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以壳聚糖-金纳米粒/碳纳米管为平台，乳酸氧化酶为标签的电化学免疫传感器用于检测CA125肿瘤标志物
关键词:CA125免疫传感器 卵巢癌 乳酸氧化酶 壳聚糖-金纳米粒
摘要：本研究开发了一种简便、灵敏的电化学免疫传感器，将其作为检测肿瘤抗原125 (CA125)的单电化学探针。以壳聚糖-金纳米颗粒/多壁碳纳米管/氧化石墨烯(CS-AuNP/MWCNT/GO)为电极基底，增加电极比表面积，改善蛋白质固定化和电极在H2O2氧化方面的；电化学性能。由于CS-AuNP类似于过氧化物酶的功能，在极低电位(0.034 V)下能观察到H2O2的氧化峰，首次将乳酸氧化酶作为单酶标签应用于三明治型免疫传感器中。在最佳条件下，设计的免疫传感器通过计时电流法(CHA)呈现出0.01-0.5 U/mL和0.5-100 U/mL的线性范围。检测限(LOD)为0.002 U/mL。与ELISA相比，该免疫传感器在检测人血清样本中的CA125方面具有良好的重现性和稳定性，选择性显著。综上所述，该设计的免疫传感器是检测和监测人血清CA125的超灵敏工具。
1. 介绍
卵巢癌是全球女性死亡率较高的妇科癌症之一(Bhoola and Hoskins, 2006;Cramer,2012)。诊断步骤在提高患者的生存率中起着重要作用起着重要的作用。因此，癌症早期的准确诊断对于后续治疗是否成功至关重要(Wulfkuhle et al.， 2003)。高死亡率主要与卵巢癌的非特异性症状和缺乏足够缺乏足够的症状有关;因此，大多数病例是在晚期诊断的(Wang et al.， 2009)。癌症的检测和监测重要工具之一是能感知癌症的生物标志物 (Wulfkuhle et al.， 2003)。CA125是临床上用于检测上皮性卵巢癌细胞的特殊和关键肿瘤标志物之一。1983年首次发现它是一种癌症抗原(Ag) (Bast et al.， 1983)。其总体卵巢癌的特异性约为80％(Clarke-Pearson, 2009)。不同的检测方法被应用于CA125的检测，包括酶联免疫吸附剂测定法(ELISA) (Butler,2000;Scholler et al.， 2006)，化学发光分析法(Chen et al.， 2015)，电化学发光免疫分析法(Xu et al.， 2012)，荧光共振能量转移分析法(Hamd-Ghadareh et al.， 2017)，电化学传感法(Johari-Ahar et al.，2015);Li et al.， 2013)。其中，电化学技术经常被采用，这在很大程度上是由于其具有高灵敏度、选择性、可靠性、操作简单和小型化等优点(Pakchin et al.， 2017)。
在电化学免疫传感器中，基于三明治型的检测方法已广泛应用于各种分子生物标志物的检测。在该方法中，具有高亲和力的生物分子如抗体(Ab)附着在电极表面。Ag与同源Ab相关联，加入带有电化学标签的二次Ab产生电化学信号(Pakchin et al.， 2017;Pei et al.， 2013)。为了实现高灵敏度的夹层式电化学生物传感器，增加电极表面附着的Abs数量和标签似乎是一个先决条件(Suginta et al.， 2013)。为了实现这样的目的，需要在电极表面上增加官能团，所以聚合物已被用于增加表面官能团数量。其中，壳聚糖(CS)作为一种含量丰富的生物聚合物，其表面含有多种内在官能团(即基于氧和氮的官能团)的表面可用于生物分子、酶和介质的共价固定化。此外，CS的其他一些重要优点使其成为电化学生物传感器发展中的首选聚合物，包括生物相容性、成膜能力、在微酸性溶液中的高溶解度、良好的透水性、可获得不同等级和分子量和机械强度(Singh et al ., 2013;Suginta et al，2013)。由于CS的导电性较低，可与碳纳米材料、金纳米颗粒等导电材料一起使用，从而提高其导电性，加速电子传递。CS的伯胺基团可以作为CS- aunps合成过程中的还原和封盖剂(Madhusudhan et al.， 2014)。此外，CS中带正电荷的胺基可以与带负电荷的碳纳米材料在弱酸性水溶液中相互作用，从而提高体系的分散性(Singh et al.， 2013)。
基于酶的标签是在免疫传感器的开发中广泛使用的最常见的标签(Pakchin et al.， 2017)。进一步地,不同类型的酶已被用作电化学免疫传感器的标签,包括辣根过氧化物酶（HRP） (Khalilzadeh et al .,2016),碱性磷酸酶(ALP)(Čadkova et al .,2015),葡萄糖氧化酶(GOD)和乳酸氧化酶(LOx)(Zhang et al .,2017)。其中，氧化酶被广泛应用于电化学生物传感器的开发。乳酸氧化酶是氧化酶之一，能够催化氧化酶乳酸转化为丙酮酸和过氧化氢（H2O2）。在电极表面，H2O2被氧化或还原，产生安培电流。H2O2的氧化或还原都需要相对较高的电位。此外，由于其缓慢的动力学和过高电位，其安培检测受到限制，可能会导致实际样品中其他电活性物种的大量干扰(Abrar et al.， 2016;Goran et al.，2011;Lamas-Ardisana et al.，2014)。因此，它被用作带有HRP的双键标签。LOx可以在原位生成H2O2，克服了H2O2扩散对HRP的限制，从而增强了免疫感受器的灵敏度(Ortiz et al.， 2014;Zhang et al.，2017)。使用LOx作为单酶标签克服上述限制，需要使用各种纳米材料对电极表面进行修饰，以减少过电位，加快反应动力学。在这方面，使用了各种纳米材料，包括金属、金属氧化物和碳纳米材料(Chen et al .， 2012)。碳纳米管(Carbon nanotubes, CNTs)具有很大的特点(例如，具有功能化可行性的高表面积)，是电极表面修饰的最佳候选材料之一。还可用于H2O2的氧化还原。另一方面，金纳米结构对H2O2的氧化还原也具有电催化作用(Chen et al.， 2012)。Jiang et al.报道CS-AuNPs(金纳米粒子)具有过氧化物酶样活性，可以促进H2O2的电化学反应。这些研究人员报道，在特定条件下，CS-AuNPs（金纳米粒子）的过氧化物酶样活性可能高于HRP (Jiang et al.， 2017)。此外，Shan et al.表明AuNPs与石墨烯的联合使用可能对其电催化性能产生一些协同效应(Shan et al.，2010)。
在目前的研究中，LOx首次作为单酶示踪剂用于制备高灵敏度电化学生物传感器检测CA125。为了检测低电位的H2O2，采用CS-AuNP/ MWCNT/GO修饰玻璃碳电极。测试表征了CS-AuNP / MWCNT / GO修饰电极在电催化性能方面对H2O2的氧化还原性，以及电化学并对CA125 标记物的灵敏度和特异性检测进行了测试。
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