基于基因工程与代谢工程方法构建大肠杆菌天冬氨酸高效生产菌株文献综述

 2021-09-25 20:31:55

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一、前言

L-天冬氨酸酶（L-Aspartase，EC4.3.1.1）是一种重要的工业用酶，用于催化富马酸和氨生成L-天冬氨酸[1,2]。L-天冬氨酸是合成甜味剂阿斯巴甜的原料，在食品、医药、化工领域有重要用途，市场需求巨大[3]。来自大肠杆菌(E.coli)中的天冬氨酸酶由aspA基因编码，基因全长1437bp，编码478个氨基酸残基。大肠杆菌菌体亦有富马酸酶（FumABC）利用富马酸生成苹果酸。国外关于天冬氨酸(Asparticacid)的研究自80年代以来,已报道了很多并开展了生产工艺的研究以及在生产上的应用等。但由于大肠杆菌生产天冬氨酸酶的作用机制上存在的问题，鲜有关于构建大肠杆菌天冬氨酸高效生产菌株的报道。本文旨在从基因工程和代谢工程两方面构建大肠杆菌天冬氨酸高效生产菌株。实验以大肠杆菌基因组DNA为模板，用PCR方法扩增天冬氨酸酶基因，并将其重组于pet28a载体中，重组质粒转化大肠杆菌表达宿主，设法通过提高基因拷贝数提高天冬氨酸酶活性，探索酶基因工程的新方法。在实际生产天冬氨酸过程中，发现伴随着苹果酸的出现。针对这一现象，利用Red同源重组敲除富马酸酶的基因，以达到构建高产菌株的目的。

二、研究内容

2.1天冬氨酸的功能与应用

天冬氨酸含有1个氨基和2个羧基，是生命体中合成赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶碱基的前体，其残基广泛存在于各种生命体中，能够传递大脑兴奋信号，调节脑和神经的代谢功能。L-天冬氨酸参与乌氨酸循环，促进氨和二氧化碳生成尿素，降低血液中氨和二氧化碳的含量，增强肝功能，因此广泛用做氨解毒剂，肝机能促进剂，疲劳恢复剂等医药用品和各种清凉饮料的添加剂[4]。天冬氨酸与L-苯丙氨酸(L-Pheny-lalanine)合成的二肽甜味剂阿斯巴甜（Aspar-tame）甜度高、热量低，适于糖尿病、高血压等患者，安全可靠；以L-天冬氨酸为原料合成的新型强力甜味剂纽甜[5]，不仅适用于包括儿童、孕妇、哺乳期妇女以及肥胖、心血管病和糖尿病患者在内的所有

人群，还适用于不能食用阿斯巴甜的苯酮尿症患者。天冬氨酸的外消旋体DL-天冬氨酸(DL-Asp)作为K 和Mg2 的载体，能够向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时还能降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用，因此可用于合成DL-天冬氨酸钾镁盐(脉安定)，可用于治疗心律失常、心动过速、心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、肝炎和肝硬化等疾病[6]。DL-天冬氨酸还可作为合成多肽的原料，它的氨基酸的取代衍生物(NMDLA)可以作为治疗神经类疾病和大脑疾病的药物[7]，如天冬氨酸的衍生物N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)能明显增强视神经单元放电单元的兴奋作用，可作为哺乳动物中枢神经系统中重要的兴奋神经递质受体之一[8]。目前，D-天冬氨酸作为一种手性药物，日益受到人们的重视。它在药物合成中主要用作药物合成的前体、中间体。田边制药公司(TanabeseiyakuCo.Ltd)把它作为一种重要的中间体来合成阿扑西林(Aspoxicillin，ASPC)[9-10]。阿扑西林是临床上使用的第一个氨基酸型青霉素注射药。Vila等[11]以D-天冬氨酸为前体合成D-天冬氨酸-β-羟胺(DAH)。DAH是一种治疗病毒感染的药物，尤其是对一些逆转录病毒具有抗性，可用来治疗AIDS、肿瘤等疑难病症。D-天冬氨酸还参与合成一些抗生素的侧链，作为β-内酰胺抗生素的侧链能提高抗生素的抗菌活性[12]。

2.2天冬氨酸酶E.coli融合表达

2.2.1材料与方法

2.2.1.1材料

菌株与质粒：E.coli、EcoliBL21菌株实验室保存，融合表达型载体为实验室构建

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