毕业论文课题相关文献综述
1.论文研究的目的和意义
手性(chirality)是生物系统的基本特征。自然界具有许多手性化合物，这些手性化合物具有两个对映异构体R-型（右旋）或S-型（左旋)。
他汀类药物(statins)，是最为经典和有效的降血脂类药物，广泛应用于高脂血症的治疗。此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，减少细胞内胆固醇的合成，从而反馈刺激细胞膜表面低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL)受体，使其数量和活性增加、使血清胆固醇水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌[1;2]。
(S)-CHBE，4-氯-3-羟基丁酸酯，是一种制造他汀类药物的关键药物中间体，可导入其他基团生成所需的手性药物中间体[13]。(S)-CHBE可用于很多活性药物的合成，它是对映体选择性合成SlageninsB和C以及他汀类药物羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂的关键手性中间体，而且(S)-CHBE还可以转化生成1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂[3~6]。从上世纪90年代开始，他汀类药物的年销售额都以20%的年平均增长率高速增长，每年都有至少3种他汀类药物进入世界十大最畅销的治疗心血管药物行列，2009年，他汀类药物的市场已经达到了317亿美元以上。因此，(S)-CHBE作为他汀类药物最为重要的手性侧链及瓶颈化合物，成为了目前羰酰还原酶生物催化与转化领域研究的热点，也是合成手性化合物的重点，同时也是利用生物技术制备高值手性化合物产业化的难点[7;8]，所以制备光学活性(S)-CHBE受到工业生物技术科研工作者的高度关注，已有很多相关研究见诸报道[9;10;11]。
由于使用羰基还原酶进行生物催化合成(S)-CHBE时，合成产物的同时会消耗一定量的辅酶，而辅酶价格昂贵，不利于工业化生产的应用。辅酶循环系统采用的酶耦联的方式实现辅酶再生，它是利用两个平行的氧化还原反应酶系统，一个酶催化底物转化，另一个酶则催化辅酶循环再生[12]，它的优点是两个酶的底物相对独立，避免两个底物竞争同一酶的活性中心。然而由于使用纯酶成本过高，酶的稳定性和寿命有限，因此现在的研究者多通过克隆脱氢酶的方式，将脱氢酶同时在重组大肠杆菌中进行表达，避免了添加商业化购买的脱氢酶，并实现辅酶的酶法再生[13]。
2.国内外研究现状和发展趋势
Zhou等[1]首次报道了用面包酵母催化COBE（4-氯-3-氧代丁酸酯）的不对称还原，而且发现反应的选择性与底物结构有关。当COBE的酯基链小于4个碳时所得还原产物为S构型，大于5个碳时为R构型，而且酯基碳链越长，所得R型产物的光学纯度越高。随后，许多研究者相继报道了微生物细胞催化COBE的不对称还原[14~19]。其中，Yasohara等[20]从400株酵母菌中筛选得到了一株Candidamagnoliae，在水/乙酸正丁酯体系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶以及反应过程中需要控制pH值的条件下产物（S）CHBE在有机相的积累浓度可达90g/L，产物的光学纯度达到96.6%e.e.。相近条件下，将表达了葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌细胞代替葡萄糖脱氢酶，与Candidamagnoliae细胞混合，在水/乙酸正丁酯两相体系中催化COBE的不对称还原，能使90g/L的底物以化学计量比转化成(S)CHBE，产物的光学纯度达到96%[21]。这些是目前产COBE还原酶的非基因工程菌细胞催化还原COBE制备手性CHBE水平最高的报道。
(S)CHBE，人们也应用基因工程技术做了相关的研究。Yasohara等[22]从酵母菌Candidamagnoliae中分离得到了一个辅酶NADPH依赖型的羰基还原酶，此酶能催化COBE还原得到光学纯度100%e.e.的(S)CHBE。将此还原酶的编码基因克隆到大肠杆菌并达到了过量表达，在水/有机溶剂两相体系中添加辅酶和葡萄糖以及葡萄糖脱氢酶，此大肠杆菌转化菌株能催化还原高浓度COBE，得到125g/L的(S)CHBE，产物的光学纯度为100%e.e.。他们课题组还将此还原酶的编码基因和葡萄糖脱氢酶基因克隆到同一大肠杆菌中并得到了共表达，在定时添加适量的辅酶NADP和葡萄糖以及连续流加底物的条件下，催化COBE的不对称还原。
由于CHBE广阔的商业前景和巨大的市场预期，各国的科研工作者分别从不同的思路和角度开展了生物催化手性合成S-CHBE的研究，如：日本京都大学、台湾义守大学、德国慕尼黑工业大学以及浙江大学、华东理工大学、江南大学等。这些研究小组分别从过程工程、代谢工程和遗传工程三个方向进行了不同的研究：1)采用过程工程研究思路的关键在于控制反应条件，例如温度、pH，以及变换细胞的处理方式加热或用内酮处理等，这些控制和处理方式可以增大底物的转化率和产物的光学纯度，这种思路的问题在于胞内酶的活性较低导致产物浓度低，细胞处理过程繁琐复杂。2)采用代谢工程研究思路的关键在于分析还原制备S-CHBE酶所处的代谢途径，通过代谢流分析，强化该条代谢途径进而获得产物高产率，这种思路的问题在于野生菌中存在多种能够催化底物为不同构型的产物导致产物的光学选择性低，尽管通过代谢途径的改造可以提高产物的光学纯度，但仍然达不到工业化的要求。3)采用遗传工程研究思路可以很好的避免以上的问题，通过过量表达还原酶能够避免野生菌中酶活力较低的问题，而通过选择合适的宿主能够解决产物手性选择性低的问题。
大部分氧化还原酶催化作用的发挥需要烟酰型辅酶[NAD(P) ，NAD(P)H]的参与，它在酶促反应中与酶结合，并作为氧化剂或还原剂直接参与反应。然而，NAD(P) 和NAD(P)H的价格昂贵，通常比酶促反应所得产物要贵得多，即使相对廉价的NAD ，其价格也至少需要大约$100/g。因此，从技术经济性的角度来看，对辅酶进行再生并循环使用是很有必要的。此外，辅酶再生能够简化产物的分离，并有利于酶促反应向正反应方向移动[23;24]。经过学者们多年的探索，烟酰型辅酶再生的研究有很大发展，目前用于NAD(P) 和NAD(P)H再生的有酶法、电化学法、光化学法等。
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