杨树WRKY基因家族的鉴定与进化
前言
为了应对逆境胁迫和适应环境，植物演变出来的一种有效的应答防御反应机制，主要通过调控基因转录表达实现。转录因子（Transcription factor，TF）是植物基因表达调控网络中的重要组成部分。WRKY基因家族是植物转录因子中最大家族之一，与生物胁迫和非生物胁迫过程密切相关，可为植物抗性育种研究提供理论基础。1994年，SPF1（Swet Potato Factor 1）基因被从甘薯(Ipomoea batatas)中克隆出，成为第一个克隆的WRKY基因。随后的植物分子生物学家又陆续在多种植物中成功分离鉴定到WRKY转录因子，并逐步开始阐明其相关的分子生物学功能和系统进化历程。然而，目前WRKY 转录因子的研究主要在草本模式植物和一些重要农作物中开展，其在木本植物中的研究相对较少。本论文以杨树WRKY基因家族为研究对象，主要开展以下几个内容研究：（1）采用BLAST-based和HMM-based两种方法在杨树核基因组范围内精确地鉴定WRKY基因家族成员；（2）通过WKRY基因家族的系统进化分析追溯其进化历史；（3）利用杨生褐盘二孢菌侵染后的杨树RNA-Seq转录数据分析杨树WRKY基因家族的表达模式。本研究结果将有助于了解WRKY基因在杨树中的具体基因数、进化历史和在杨树响应杨生褐盘二孢菌侵染过程中所起的作用，以及该基因家族在草本植物与木本植物之间存在的差异。
1.文献综述
1.1 杨树与杨树黑斑病
杨树是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus L.）落叶乔木的总称，具有重要经济价值（胶合板材、纸浆材、实木材和包装材等）和生态作用（保持水土、防风固沙和园林绿化等）。杨属树种的天然分布主要区位于北半球的亚热带、温带及寒温带，该属包含一百余个种（Species）。杨属一般可以分成五大派（组）：青杨派（Sect.Tacamahaca，e.g.毛果杨和小叶杨）、白杨派（Sect.Leuce，e.g.欧洲山杨、美洲山杨和毛白杨）、黑杨派（Sect.Aigeiros，e.g.欧洲黑杨、美洲黑杨和欧美杨杂种）、胡杨派（Sect.Turanga，e.g.胡杨）和大叶杨派（Sect.Leucoides，e.g.大叶杨）。由于杨树独特的生物学特性，例如基因相对较小、遗传转化相对较容易、生长迅速、世代周期较短等，杨树成为了木本植物研究中的一种模式物种。2006年，毛果杨（Populus trichocarpa）成为继拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）之后第三个完成全基因组测序的物种，也是第一个完成基因组序列图的木本植物，相关研究结果发表于《Science》杂志（Tuskan et al., 2006）。2013年，适应沙漠地区的中国乡土树种——胡杨（P. euphratica）的全基因组测序工作完成，胡杨成为杨属内第二个被完成基因组序列图的物种，其研究结果报道于《Nature communications》期刊（Ma et al., 2013）。
与所有植物一样，杨树在其整个生命过程需要面对各种生物和非生物的刺激或胁迫。为了适应、抵抗和耐受这些生物/非生物胁迫，杨树在长期进化过程中势必会产生多种机制和复杂的信号网络去应对这些刺激。基因表达的转录调控是这些机制和信号网络的重要组成部分，在胁迫响应过程也将起到重要作用。
杨树黑斑病（Black spot disease）是一种重要的杨树叶部真菌性病害，容易造成叶片成熟前脱落和光合作用效率降低，严重影响杨树生长量和木材产量。病斑主要在叶正面，直径1~5mm，初为红色，边缘较深，后变为黑褐色，圆形或多角形，中间有乳白色胶黏状的分生孢子堆。老叶病斑初为黑褐色，后病斑多时连成大片，叶变黑枯死。后期加杨叶背面也有病斑和孢子堆。叶柄上病斑为红棕色小点，后成梭形，黑褐色，稍隆起，中间产生带红色的分生孢子堆，嫩梢木质化后，病斑成溃疡斑状，发病重的嫩梢冬季常枯死。
杨生褐盘二孢菌（Marssonina brunnea）是杨树黑斑病的主要致病菌之一，属于半知菌亚门、腔孢纲、黑盘孢目的盘二孢属（Marssonina）真菌。杨生褐盘二孢菌的分生孢子盘小，位于寄主角质层下；其分生孢子双细胞，卵形或倒卵形，无色，有一分隔，分隔处稍缢束，形成2个大小不等的细胞。2012年，南京林业大学杨树课题组利用Roche 454、Illumina Solexa GA II和ABI SOLiD三种二代测序平台完成了杨生褐盘二孢菌的基因组测序工作，研究结果发表于《BMC Genomics》期刊（Zhu et al., 2012）。
1.2 植物转录因子
植物进化史上的里程碑事件之一就是植物从水生环境到陆生环境的演化。大约 4.75 亿年前，陆生植物的祖先——绿藻（Charophyta）第一次登上了陆地边缘，之后为了适应陆生环境，藻类在形态学和基因组水平上都发生了诸多变化，不同于能够通过移动避害的动物，藻类等植物作为一种固着性生物，在长期进化过程中，形成了多种机制和复杂的信号网络，从而迅速地感知外界环境，调控基因的表达，以适应、抵抗和耐受各种生物和非生物的胁迫。
基因表达的转录调控在植物胁迫响应过程中起重要作用。转录因子(Transcription factor，TF)是调控基因转录表达的重要组成部件，影响胁迫相关基因表达调控网路中的上下游基因（目标基因）表达量。转录因子是一种反式作用因子（Trans-acting factors），能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对目标基因的转录起有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。典型的转录因子一般具有 4 个功能区：DNA结合区（DNA-binding domain，DBD）、转录调控区（Trans-activating domain，TAD）、核定位信号区（Nuclear localization signal，NLS）和寡聚化位点（Nucleotide oligomerization domain，NOD）。而根据DNA结合域结构的不同，转录因子又可分为 MYB、WRKY、NAC、Zinx finger（锌指蛋白）等诸多家族（伍林涛等，2013），其中转录调控因子WRKY 基因家族是植物特有的超级基因家族，也是植物中最大的转录因子家族之一。
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