基于SSR分子标记黑枸杞遗传多样性研究文献综述

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黑枸杞果实转录组测序与SSR分子标记开发

1. 文献综述

1.1 黑枸杞简介

1.1.1 黑枸杞生物学特性

黑枸杞( Lycium ruthenicum Murr.) 亦称黑果枸杞，为茄科( Solanaceae) 枸杞属( Lycium）植物。其具体形态特征见表1.1。全世界枸杞约有80余种，我国分布有7种、3变种。黑枸杞与宁夏枸杞、截萼枸杞3个种以及黄果枸杞1个变种共同分布于宁夏地区^[1]。黑枸杞为药食同源植物，在国内使用黑枸杞入药或食用已有两千多年历史，且黑枸杞也是我国分布最广，资源利用度较高的枸杞种^[2]。

表1.1 黑果枸杞形态特征

注：表中内容引自 1978《中国植物志》第 67（1）卷 010 页

1.1.2 黑枸杞地理分布

黑枸杞耐干旱，常生于盐碱土荒地、干旱荒漠、沙地、高山沙林中或道路旁。由于其适应生境的特点，其于国内主要分布于我国西北部，即陕西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆和西藏等地；于世界范围内，主要分布于中亚、高加索和欧洲。

1.1.3 黑枸杞利用价值和经济价值

黑枸杞果实较之于红枸杞的果实，其所含氨基酸、枸杞多糖、蛋白质、矿物质、维生素和微量元素等营养成分远高于红枸杞；黑枸杞中的铁、钙、镁、锌、铜的含量远高于其平均含量，钾、锰的含量远低于其平均值，钠含量与其基本相当。黑枸杞含有多种人体必需的氨基酸，其中谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量较高。黑枸杞最突出的有效成分为花青素，含量超过蓝莓，其富含的天然花青素是一种强效的抗氧化剂，功效为维生素C的20倍、维生素 E的50倍^[3]，可防止人体机能早衰、增强血管弹性。此外，通过药理研究，已证明黑枸杞具有降低胆固醇、兴奋大脑神经、增强免疫功能、防治癌症、抗衰老、美容养颜等功效^[4]。因此，黑枸杞既可用作日常生活中的滋补保健产品和食材，也具有等一定的药用价值。随着人们养生观念逐渐加强，黑枸杞在如今的保健品市场中脱颖而出，逐渐得到人们的青睐。

1.2 转录组测序概述

• • 1. 转录组测序的定义与功能

随着后基因组的时代到来，转录组学成为各相继出现的组学技术中率先发展起来并且应用最广泛的技术^[5]。遗传学中心法则表明，遗传信息在精密的调控下通过信使RNA( mRNA) 从DNA传递到蛋白质。因此mRNA被认为是支持蛋白质与DNA之间生物信息传递的“桥梁”，而全部表达基因的身份及其转录水平综合起来，被称作转录组( Transcriptome) ^[6]。转录组是指特定细胞或组织在某一发育阶段或功能状态下，转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA( non-coding RNA, ncRNA) ^{[6, 7]}。转录组的研究是基因功能与结构研究的出发点和基础，要解读基因组功能元件、揭示细胞及组织中分子组成，了解转录组是必需的，另外，其对理解机体发育和疾病也具有重要作用。进行整个转录组分析，其主要目标是：(1)对所有的转录产物进行分类；(2)确定基因的转录结构，如其起始位点，5′ 和3′ 末端，剪接模式和其他转录后修饰；(3)量化各转录本在发育过程中和不同条件下表达水平的变化^{[6, 7]}。

• • 1. 转录组测序的应用

近年来，由于转录组测序技术( RNA-seq，RNA sequencing) 的发展，通过高通量测定转录组cDNA的序列揭示特定细胞或组织中表达的全部基因或表达序列标签( EST, expressed sequence tag) ，已在许多作物上得到广泛应用，并开发出了大量转录水平的分子标记。利用转录组数据开发的SSR标记既有EST-SSR标记的优点，其海量数据又为SSR标记的开发提供了较之EST-SSR更全面的信息，能够提高遗传多样性和分子标记辅助育种研究的准确性，较经典的SSR标记开发方法能够简化SSR克隆筛选、测序、cDNA文库构建等繁琐程序，大程度降低了工作量与开发成本^[8]。

因具上述条件，转录组测序目前已广泛运用于各植物分子水平的各项研究。许波等^[9]完成的玉米基因组测序，有力推动了玉米转录组结构的注释和功能的深入解析。其掌握了玉米基因组研究的概况，并利用GSFLX等测序技术，将转录组测序应用在玉米新基因挖掘、分子标记开发和分子进化等相关研究领域，为深入研究玉米的复杂农艺性状的分子机制、不同发育阶段的基因表达调控网络以及分子设计育种等工作提供参考。刘娜等^[10]通过对嫁接西瓜进行转录组测序，发现嫁接参与调控了植物的多种生物代谢途径以及胁迫响应过程，为进行嫁接对植物生长和抗逆性的影响研究开辟了新视角，并提供了有可能受嫁接调控的基因库，有利于进一步从分子水平揭示嫁接对植物影响的机制。朱雪冰^[11]通过对黑枸杞与红枸杞的果实生物信息学分析和高通量转录组测序，分析黑枸杞与红枸杞中部分基因的表达与结构差异，进行了目标基因克隆及分析，建立起外植体叶、茎的野生黑枸杞的再生组织培养体系，为黑枸杞新品种选育提供良好的理论和实验基础。

1.3 SSR分子标记概述

1.3.1 SSR分子标记的定义与特点

广义的分子标记是指可遗传且可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。分子标记技术主要可分为两大类：一、基于分子杂交技术的分子标记技术，此类标记技术利用凝胶电泳及限制性内切酶解对不同的DNA分子进行分离，继而用经过标记的特异DNA探针与之杂交，通过非同位素显色技术或者放射自显影技术揭示DNA的多态性。该技术又可分为两种： (1) 限制性片段长度多态性( Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 但其存在信息含量低、操作繁琐等缺点 ^[12]； (2) 数目可变串联重复多态性( Variable Number of Tandem Repeats, VNTR) 。二、基于PCR技术的分子标记技术，此类标记技术引用随机的核苷酸序列，事先未知其扩增的DNA区域。随机引物PCR( polymerase chain reaction) 扩增的DNA片段产生的多态性分子基础，为模板DNA扩增片段上引物结合位点的碱基序列的突变，基因组由于来源不同，在该区段上会表现为扩增产物有无差异或者扩增片段差异的大小。随机引物PCR标记表现为共显性或者显性。该类技术分为两种：(1) 随机引物的PCR标记( Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD) ，包括：①随机扩增多态性DNA( RAPD技术) ②任意引物PCR( Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction, AP-PCR) ③DNA扩增指纹印迹( DNA Amplification Fingerprinting, DAF) ；(2) 特异引物的PCR标记，其标记所用的引物是针对已知序列的DNA区段设计的，包括：①序列标志位点( Sequence Tagged Sites, STS) ②简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR) ；③序列特异性扩增区(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR) ；④单引物扩增反应(Single Primer Amplificatipn Reaction，SPAR) ；⑤DNA单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP) ；⑥双脱氧化指纹法(Dideoxy Fingerprints，ddF) 。其中RAPD分子技术虽然可以检测多个基因位点，但不能识别杂合子位点 ^[13]，且试验重复性差 ^[14]；AFLP分子技术虽相较于RFLP和RAPD两种分子技术具更高的稳定性，但对反应条件和基因组纯度要求较高 ^[15]；ISSR分子标记采用随机引物，而SSR分子标记利用特异性引物进行标记。此外还有基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记以及基于DNA芯片技术的分子标记技术等。

简单重复序列( simple sequence repeat, SSR) 也称为短串联重复序列( simple tandem repeats）或微卫星标记( microsatellite markers) ^[16]，即以聚合酶链式反应( PCR) 技术为基础的共显性分子标记，是由1-6个碱基组成的一类基元串联重复的DNA序列，一般长度在200bp以下，广泛分布在基因组的不同位置，SSR为共显性分子标记，可区分纯合子与杂合子。SSR分子标记法于1991年由 Moore 等创立，是现今流行的分子标记技术之一^[17]。根据串联重复序列的来源，SSR分子标记法主要可分为两种：由功能基因( 如rRNA与组蛋白基因) 组成的基因组SSR( genomic SSR，gSSR) ，利用转录组序列开发的转录组SSR( EST-SSR) 。由于其在个体间的重复单位中的重复次数呈现出高度变异性和数量丰富等特点，因而具有重复性高、多态性高、易检测、共显性、无放射、操作简单、所耗时间较短、覆盖面广等优点，故在DNA指纹图谱的构建、遗传多样性分析、基因定位和分子标记辅助育种等方面得到广泛应用^[18]。研究通过转录组测序的方法，获得红果枸杞和黑果枸杞的果实发育事情的转录组序列，进行微卫星位点的预测，并利用PCR技术对获得的微卫星位点进行鉴定。

1.3.2 SSR分子标记在林木中的应用

SSR分子标记作为近年逐渐发展起来的一种以特异引物——PCR为基础的分子标记技术，与其他分子标记相比具有分布广泛、数量丰富、稳定性好、多态性高等优点，可鉴别出纯杂合子的共显性等遗传特征^[19]。因此SSR标记已被广泛应用于林木的品种鉴定、亲缘关系和遗传多样性、遗传图谱和系谱构建以及基因标记等方面的研究。

利用转录组序列开发的SSR标记具有上述优点，因其与功能基因关系密切，因此在近缘种群内具有较高的通用性。近年来随着新一代测序技术的发展，能快速大量的获得转录组数据使得SSR分子标记迅速发展，很多学者已经利用转录组SSR分子标记的方法对各种植物的遗传等方面进行了大量的实验和研究，目前已在农业植物、经济林木等领域得以广泛运用^[20]。在农业蔬菜南瓜中，朱海生等^[21]对美洲南瓜( Cucurbita pepo L.) 开展转录组测序分析，利用美洲南瓜转录组数据进行SSR标记开发能获得较高频率的SSR位点，且类型丰富，为美洲南瓜遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。在珍贵树种红豆杉中，武星彤^[22]以NCBI数据库中的4种红豆杉转录组序列为基础开发南方红豆杉的EST-SSR分子标记，研究结果对红豆杉属物种保护与分子育种具重要意义。其进一步明确红豆杉属分类关系，并应用开发的高效分子标记对群体进行父本分析，将为红豆杉的遗传图谱构建、分子标记辅助育种、品种鉴定等提供理想的分子标记，也可为研究红豆杉属的群体遗传多样性、建构红豆杉Unigene数据库等提供坚实的理论基础，利于红豆杉属的资源开发、利用及保护。在园艺栽培植物葡萄上，THOMAS^[23]等开发的微卫星序列为鉴别欧亚葡萄品种( Vitis vinifera L. ) 提供了有价值的理论基础，发现SSR位点可转移到葡萄属不同种的研究，同时发现其SSR标记为共显性遗传，适合用于构建遗传图谱以及遗传关系的研究。在药用栽培植物轮叶党参Codonopsis lanceolata ( Sieb. et Zucc. ) Trautv. 中。刘新星^[24]开发 EST-SSR 标记，分析其在党参属及近缘属种间的通用性，研究筛选出的 EST-SSR 标记能够在党参属及近缘属内进行区分鉴别，研究结果为党参种质鉴别、遗传多样性分析及资源的评价利用等提供了重要技术手段。

研究表明，运用SSR分子标记技术进行植物遗传多样性及亲缘关系的分析，可选出更加优质的品种或通过分子标记辅助育种带来更多的经济价值^[25]。

1.3.3 SSR分子标记在黑枸杞中的应用

目前针对枸杞的种质资源的遗传多样性分析，国内外学者已采用多种方法初步进行了如构建枸杞的DNA指纹图谱等相关的多方面研究。邵千顺等^[1]以17份枸杞资源为试验材料，采用SSR技术，研究宁夏枸杞系列品种、其它枸杞种/品种和野生类型的遗传多样性与指纹图谱，发现非栽培的枸杞比栽培品种具更丰富的多样性，其研究结果为枸杞遗传图谱构建和品种鉴定等奠定了技术基础。尚杰等^[26]利用RAPD技术对宁杞1号、宁杞2号、宁杞3号 和宁杞4号4个宁夏枸杞栽培品种及3个宁夏野生枸杞 进行了遗传多样性分析；zhang等^[27]使用6种枸杞属植物作为试验材料，其中2份正品，4份混淆品种，运用RAPD技术对其分析，获得了枸杞属内不同种的特异性DNA指纹图谱，从而将它们准确区别。赵鑫等^[28]利用Illumina测序技术得到的枸杞转录组中SSR位点出现频率高，类型丰富，对今后枸杞遗传多样性的研究以及种质资源鉴定打下了良好的理论基础。

1.4 研究的目的与意义

随着近年来人们对黑枸杞药用价值的研究和重视度提升，转录组测序技术和SSR分子标记开发在各植物上的运用频率提高，而目前国内外对黑枸杞果实转录组测序以及对其的SSR分子标记开发未有实际成果。为更充分开发黑枸杞种质资源，并填补相关方面研究成果的空缺，本研究主要通过分析苦黑枸杞叶片转录组序列信息，包括编码基因长度，编码基因数目，编码基因可能的功能注释，并且基于黑枸杞转录本信息，开发与设计SSR分子标记，同时在黑枸杞种质资源中验证SSR标记的多样性。解析黑枸杞转录组基因序列信息，探究黑枸杞中转录基因的潜在功能，为黑枸杞的基因功能研究提供重要的基因序列信息参考。另外开发与设计一套适合用于黑枸杞种质资源多样性评价的分子标记，将有利于充分挖掘与利用优异黑枸杞种质资源。

参考文献

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资料编号：[247030]

黑枸杞果实转录组测序与SSR分子标记开发

1. 文献综述

1.1 黑枸杞简介

1.1.1 黑枸杞生物学特性

黑枸杞( Lycium ruthenicum Murr.) 亦称黑果枸杞，为茄科( Solanaceae) 枸杞属( Lycium）植物。其具体形态特征见表1.1。全世界枸杞约有80余种，我国分布有7种、3变种。黑枸杞与宁夏枸杞、截萼枸杞3个种以及黄果枸杞1个变种共同分布于宁夏地区^[1]。黑枸杞为药食同源植物，在国内使用黑枸杞入药或食用已有两千多年历史，且黑枸杞也是我国分布最广，资源利用度较高的枸杞种^[2]。

表1.1 黑果枸杞形态特征

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