春兰CgARF8基因的克隆与生物信息学分析
2.1春兰概况
兰科（Orchidaceae）是植物界的一个庞大家族，单子叶植物中最大的一个科，其植物种类繁多，有地生、附生和腐生三大种类，多产于热带地区和亚热带地区，少数种类也见于温带地区。中国幅员辽阔，气候、地理环境条件复杂多样，特别是拥有广阔的亚热带地区和青藏高原等独特地理区域，因此特有属和特有种现象尤其突出，诸多有利条件使得中国的野生兰科植物资源的研究和保护成为世界兰科植物研究和保护的重要内容。其中春兰是人们十分喜爱的传统兰花之一，在中国有着十分悠久的栽培历史。春兰 (Cymbidium goeringii Reichb.F.) 是兰科兰属多年生地生草本植物，由3枚萼片、2枚侧瓣和1枚唇瓣，以及处于花器官中心部位的合蕊柱组成，又名朵朵香、双飞燕、草兰、扑地兰。其根肉质，叶短而狭；假鳞茎呈球形，叶狭带形，边缘具细锯齿；花单生，少数2朵，常为浅黄绿色，绿白色或黄白色，花葶直立，具香气；萼片中脉基部有紫褐色条纹，花瓣卵状披针形，稍弯，基部中间有红褐色条斑，唇瓣3裂不明显，色浅黄，有两条褶片[1]。 春兰品种甚多，按花被片的形态又可分为梅瓣、水仙瓣、荷瓣、畸瓣和竹叶瓣5种瓣型，具有较高的研究和观赏价值。
就兰花栽培而言，我国是世界上最早栽培和拥有最多爱好者的植物，且主要集中在春兰集中在春兰、蕙兰、建兰、墨兰和寒兰等5类兰科植物，栽培历史悠久，文化源远流长，最早的文献描述可追溯到公元860年。随着兰花栽培技术的成熟与发展及兰花栽培专著增多，描写兰花的诗词、绘画也越来越丰富，因此在中国，人们欣赏兰花，不仅仅只是欣赏花，而是涉及到香气、叶姿、叶艺、盆架以及与兰有关的一切人和物，形成中华民族独特的兰文化艺术。且在兰花研究方面, 从形态分类、生态生理、传统的遗传育种栽培到分子细胞生物技术的应用, 几乎都有人在研究，而且在许多方面处于世界领先水平，这些研究为我国兰花的商品化开发奠定了坚实的技术基础。此外，20世纪80年代以来，由于我国对外交流的日益广泛，国外的花卉生产对我国传统栽培有了很大影响，到80年代后期，国内兰花生产由为自己观赏发展到为出售的商品化时代[2]。随着人们物质生活水平的提高，精神生活水平的要求也在不断上升，国内兰花消费持续上涨。近年来，兰市盛行的炒作之风，也进一步推动了春兰新品种的发现与研究。国内外贸易市场的交流，使得春兰面向了全国乃至整个世界，开辟了新的国际市场。因此，就兰花中的春兰而言，不论个体经营还是企业生产，其利润盈利十分丰厚，具有良好的市场产业发展前景。
2.2兰科基因克隆与生物信息学分析相关研究进展
2.2.1兰科基因克隆相关研究进展
兰花是一类重要的观赏花卉，由于品种的复杂多样性，有的品种营养生长期较长，长达数年才会开花，给杂交育种及花发育研究造成困难。兰花杂交育种进展缓慢，其重要原因是其杂交种子萌发难，杂种试管苗出苗率低。目前，兰花育种主要以传统的人工杂交为主，我国兰花杂交育种起步晚，品种改良缓慢，且后代性状容易分离，难以保持母本优良性状[3]。研究人员发现，通过调整兰花组织培养基中的营养和激素水平可大大缩短营养生长周期，诱导提前开花。通过实验发现，春兰times;大花蕙兰杂种的原球茎在添加6-BA和NAA的培养基上继代培养2个月即可形成花蕾，这为克隆兰花发育基因提供了较好的试验材料和试验系统[4]。
春兰(Cymbidium goeringii)是兰花的主要种之一，花型奇特，与多数高等植物花器官单纯的萼片、花瓣、雄蕊群、雌蕊群不同，春兰从外向内依次为，花瓣状的萼片、两片侧瓣、高度特化的唇瓣、雄蕊群和雌蕊群合生成高度特化的合蕊柱。1991年，Coen和Meyerowitz提出植物花器官发育ABC模型[5]。2001年，Theibeta;en等提出植物花器官发育ABCDE模型，认为植物花器官的形成由5类功能基因A、B、C、D、E共同调控[6]。对于花发育机理的研究，主要是以双子叶植物中模式植物金鱼草(Antirrhinum majus)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)为主，单子叶植物中也是集中于禾本科植物，如水稻 (Oryza sativa)、玉米(Zea mays)，其他单子叶植物领域有待研究[7]。兰科作为植物界四个特大科之一，因其高度特化的花器官，吸引了不少研究人员的探索。主要研究对象有蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)、文心兰(Oncidium ssp.)、石斛(Dendrobium hybrid)，近年来对兜兰(Paphiopedilum hybrid)、萼脊兰(Sedirea Japonica)、大利红门兰(Orchis itlica)等兰科植物的花发育研究也取得了一些进展，包括A、B、C、D、E类不同基因类型[8]。研究表明，各类基因在兰花的成花转换及花器官形成过程中起重要作用，尤其是B类基因的表达及功能可能与兰花结构的特异性及多样性关系较为密切[8]。目前已从拟南芥(A.thaliana)、金鱼草(A.majus)、姬蝴蝶兰(P.aphrodite)等植物中克隆得到了花发育相关的B类MADS-box基因，表达模式各不相同[9]。文心兰(Oncidium ssp.)的OAP3基因在分生组织和花序组织中都有表达[10]；春兰(C.goeringii)的CgGLO基因主要在萼片、侧瓣和唇瓣中表达[11]。DEF4基因及其同源基因属于MADS-box家族B类基因的Paleo AP3组，目前姬蝴蝶兰(P.equestris)、蕙兰(Cymbidium faberi)、细茎石斛(Dendrobium moniliforme)、文心兰等植物的DEF类基因得以克隆以及功能验证[12]。根据进化分析，将DEF类基因分为4大类，目前已克隆的第1类为Pe MADS2类基因，第2类为OMADS3基因，第3类为Pe MADS3基因，第4类为Pe MADS4类基因[13-14]。第1、2类基因控制兰花花被片的形成，第3类基因仅在侧瓣和唇瓣中表达，第4类基因只在唇瓣中表达，进一步表明了4个DEF类基因共同调控兰花萼片、侧瓣和唇瓣的形成[13-14]。
2.2.2兰科生物信息学分析相关研究进展
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