小叶杨基因组SSR标记识别及引物设计和鉴定
小叶杨（Populus simonii）是我国北方地区常见的乡土树种，具有较高的生态和经济价值，且因栽培历史悠久、种内遗传变异丰富，且抗旱性和生根能力强、适应性广、种间杂交亲和性好，一直以来被杨树育种工作者认为是选育杨树无性系品种的最佳亲本之一。综上，小叶杨在育种工作、经济建设和生态发展方面都发挥着比较重要的作用。但近年来，小叶杨的优势被逐渐遗忘，仅有少部分地区仍坚持小叶杨的栽培和育种工作，这对小叶杨资源的保存是不利的。在这种背景下，基于小叶杨的基因组数据进行SSR标记的识别和引物设计，有助于阐明小叶杨现存遗传资源的遗传结构和变异规律，为小叶杨的分子标记辅助育种和资源保存提供理论支撑。此外，小叶杨基因组SSR标记的开发也可以为小叶杨数量形状位点分析、遗传疾病的预测与诊断、亲权分析与种质鉴定，种群及进化分析提供依据。
1.小叶杨
1.1小叶杨的生物学特性
小叶杨（Populus simonii）属于杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus），是我国北方地区常见的乡土树种。小叶杨为落叶乔木，高20米，胸径大于50厘米。幼树树皮灰绿，老时暗灰，有沟状裂；树冠近乎圆形，幼枝多红褐色，可见明显棱脊，成熟的小枝黄褐色，圆形无毛；芽呈褐色而细长。叶片多菱状卵圆形，无毛，长3-12厘米，宽2-8厘米，叶缘细锯齿，上面淡绿色，下面灰绿。雌雄异株，裸花，密集排列成葇荑花序。蒴果无毛，2 (3)瓣裂。
1.2小叶杨的地理分布
小叶杨是喜光树种，适应能力强，适合生长在黑土地带，与青杨派其他树种耐大气干燥及极端高低温，耐旱抗寒，耐瘠薄或弱碱性土壤，在砂、荒和黄土沟谷也能生长，但在湿润、肥沃土壤的河岸、山沟和平原上生长最好。由于小叶杨对气候和土壤并没有严格的要求，因而小叶杨在我国分布广泛，东北、华北、华中、西北以及西南地区均产，北起黑龙江、南至四川、东达山东、西到青海共18个省市自治区均分布有小叶杨的天然林，其中辽宁、山西、陕西、甘肃、河北、河南、山东等地最多。在长期的树种环境互作过程中，小叶杨产生了多种变种和变型，以适应不同的环境，《中国植物志》中记载了8种变型或变种，包括宽叶小叶杨 (P.s.var.latifolia) 、辽东小叶杨 (P. liaotungensis) 、圆叶小叶杨 (P.s.var.rotundifolia) 、秦岭小叶杨（P.s.var.tsinlingensis）、菱叶小叶杨（P.s.var.rhombifolia）5个变种，扎鲁小叶杨（P.s.f.robusta）、垂枝小叶杨（P.s.f.pendula）、塔形小叶杨（P.s.f.fastigiata）3个变型，这些变种和变型在形态和生理上都存在一定的差异。
1.3小叶杨的用途
小叶杨的木材轻软、细致，便于加工利用，可以用于民用建筑，制造家具，作为生产火柴杆和造纸的原材料。而且，小叶杨的根系发达，抗风能力强，可作为防风固沙和护堤固土树种，也是东北和西北防护林和用材林的主要树种之一。除此之外，小叶杨树形优美，可以作为绿化观赏树种，用于园林绿化。因此，小叶杨具有重要的生态和经济价值。
1.4小叶杨的开发应用
为了防止杨树品种过于单一，优化良种结构，从而促进良性生态循环，提高抗病和抗虫能力，实现稳产高产，是全世界杨树育种的主要任务和持久目标。小叶杨因栽培历史悠久、种内遗传变异丰富，且抗旱性和生根能力强、适应性广、种间杂交亲和性好，一直以来被杨树育种工作者认为是选育杨树无性系品种的最佳亲本之一。目前各地已经培育出许多小叶杨杂种，其生长和抗性表型良好，如群众杨、小意样杨、小黑杨类、小钻杨类、黑小杨类等。
2.DNA测序技术
DNA测序（DNA sequencing）是一种可以读出目的片段碱基排列顺序的技术。DNA测序技术发展到现在，已有40多年历史。2017年Shendure等人在《Nature》杂志上发表的一篇综述回顾了DNA测序的40年历史，并预测预测长远来看，DNA测序的影响将与显微镜不相上下。在过去的40年中，DNA测序技术经历了数次革命，从低通量、繁琐手动的第一代Sanger测序到如今的高通量、自动化的第二、三代测序技术。在此期间，我们见证了人类基因组计划的完成和其他数百万物种基因组的破译，可以说基因组学领域的最新进展很大程度上依赖于DNA测序成本的降低和通量的增加。在获得基因组数据后，人们又提出众多的问题，这些问题推动着我们去进一步解读基因组，由此开创了后基因组学时代。综上所述，DNA测序技术在基因组学相关领域发挥着十分重要的作用，了解DNA测序技术的发展有助于我们在研究时选择合适的测序技术以获得更好、更精确的结果。
2.1第一代DNA测序技术
在实现DNA测序之前，人们已经发明了蛋白质测序技术和RNA测序技术。1968年，Wu最早通过引物延伸法最先测定了噬菌体粘性末端的12个碱基。1973年，Gilbert和Maxam通过将DNA拷贝到RNA中，对RNA进行测序，从而实现了乳糖抑制子结合位点24个碱基的测定。上述两项研究耗费了研究者数年时间，测序速率十分慢。1976年Sanger和Gilbert分别提出了链终止测序法和化学修饰法，大大改善了测序效率低的局面。上述两种方法都被称为第一代测序技术，但链终止法的影响更为深远，几乎所有基于第一代测序技术的测序仪器都是在链终止法的基础上开发的，所以我们重点关注链终止法。链终止法的反应体系包括：目的DNA片段、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸（dNTP）、引物和放射性同位素标记的双脱氧核糖核苷酸（ddNTP），其核心原理是ddNTP的2#39;和3#39;端都不含羟基，因此在合成核酸链的过程中无法形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断，将反应片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行放射自显影，即可逐个读出目的片段的碱基序列。但链终止法步骤比较繁琐，而且不能实现自动化，效率并不太高，1987年Smith基于链终止法，用荧光标记代替放射性同位素标记，发明了自动化的DNA测序仪，将测序速度提升至1000bp/D。此后，第一代测序技术又经历了几次变革，毛细管电泳技术取代了传统的聚丙烯酰胺平板凝胶电泳，测序速度进一步提升。到了2004年，人们已经完成了人类基因组的绘制，测序价格也降至每1bp花费1美元。
2.2.第二代DNA测序技术
虽然第一代DNA测序技术的错误率较低，每个反应的读长可达到1000bp且成本低廉，但它的测序通量很低并且测序总成本较高。在这种背景下，第二代测序技术应运而生。第二代测序又称高通量测序技术、下一代测序技术（Next Generation Sequencing, NGS），它具有高通量、低成本的优点，并且摒弃了第一代测序体外扩增的繁琐步骤，采用边合成边测序的方法。目前成熟的第二代测序技术有3种，分别为Roche公司的454技术、ABI公司的SOLiD技术和Illumina公司的Solexa技术，在测序市场占主流的是Illumina公司。
Illumina公司的第二代测序仪最早由Solexa公司研发，采用边合成边测序的方法，其基本过程是：1）测序开始前，通过加在DNA片段末端的接头与引物碱基的互补、固定，使之形成桥状结构；2）在测序的过程中，加入改造过的DNA聚合酶和4种带有荧光标记的dNTP，因为dNTP的3#39;羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基；3）用激光扫描反应板表面，根据dNTP所带的荧光读取每条模板序列每一轮反应所聚合上去的核苷酸种类，经过“合成-清洗-拍照”的循环过程，最终得到目的片段的碱基排列顺序。NGS的出现使得测序成本大大降低、测序通量大幅增加，只需要数千美元，一个研究生就可以在两天内获得超过10亿个独立的读长（read）。
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