双循环无机物-酶晶体的制备与性能研究
摘要：胰蛋白酶是用来催化水解蛋白质的一种特异性较强的酶，在脊柱动物中作为消化酶使用。据研究，游离态酶，以及通多传统固定化方法得到的酶晶体具有很多的缺陷。但是不起前两者，新型杂化纳米花固定酶的方法具有众多优势，不仅可以提高酶的催化活性和稳定性，还可以提高酶和无机物的重复使用率。本实验根据国内外研究者的研究方法，将对探究制备胰蛋白酶酶晶体的最适条件、动力学与温度稳定性研究，同时将对材料中的Ca2 进行回收利用，实验化学的绿色化。
关键词：胰蛋白酶； 固定化； 催化活性；循环
一、文献综述
1、酶的固定化
酶作为一种具有高度催化效率、高度专一性的蛋白质，在生物体中，几乎所有的化学反应都需要酶的催化作用。一般我们从生物体中提取以及通过微生物发酵而合成的酶都是游离状态的，但是游离状态下的酶所需要的反应条件比较温和，对于一些激烈的条件，比如强酸强碱、温度较高条件下，游离酶的稳定性下降，催化效果下降，甚至有时会完全失活，导致完全体现不出酶的催化作用。同时据研究发现，反应后也很容易混入催化产物等物质，也不能从反应介质中分离得到[1]，纯化比较困难。
上世纪60年代兴起了一种可以解决游离酶反应条件比较苛刻的方法，即酶的固定化技术。传统的酶的固定化方法一般包括吸附法、包埋法、化学共价法和交联法四大类[2; 3]。其中，吸附法是科学家最早研究出来的固定化方法，是一种实用性较强的方法。Oujji等人[4]研究出了一种生物分析方法，将乙酰胆碱酯酶通过吸附法固定在Maxi Storp TM微盘上，从而进行有机磷的分析测定。但酶与载体之间存在着一种弱结合力，酶的固定化效果差。在一些特殊的条件下，酶从载体上脱落的几率就会大大增加，并且很可能会污染催化反应的体系。包埋法是一种将酶包埋于聚合物的孔隙中的一种固定化方法。利用聚丙烯酰胺、聚乙妇醇、明胶、海藻酸等载体的细微网格将酶包埋进去的方法称为网格型包埋。张斌等人[5]以海藻酸钠为载体，采用交联-包埋方式固定beta;-葡萄糖醛酸苷酶，研究表明利用该固定化酶方法的回收率较高，可达到71.66％。化学共价法是酶与载体通过化学共价键的方式进行结合的固定化方法。Singh等人[6]通过该方法把漆酶固定在活化的氨丙基三乙氧基硅烷上，测定后得固定化效率在50-60%，固定化酶的酶活比游离酶的酶活增大4倍。交联法是在化学共价法的基础上，利用多官能团试剂使酶与载体之间发生交联反应而实现彼此连接的固定化方法。Tian等[7]把戊二醛作为交联剂，在壳聚糖微球的表面固定血管紧张素转移酶，实验结果表明，固定化酶的存储稳定性、热稳定性均增强了。但该方法反应比较剧烈，容易使得酶失活。
在过去的几十年中，科学家们开发了各种固体载体，其中一种是以酶-无机杂化纳米法的方法对酶进行固定。早前，Zare的研究小组[8]研究出了一种通过共沉淀方法合成杂合纳米花的方法。它是以酶为有机组分，以磷酸盐为无机组份进行固定，利用蛋白与无机金属离子之间的相互作用，通过自主装形成各种形状的杂化结构，导致具有纳米级特征并且形状像花瓣的微米尺寸颗粒的生长。由于这种新型的酶的固定化制备方法简单和普适性强，同时，类花状纳米材料（纳米花）与体材料相比具有较大的表面体积比，有利于传质过程，也能显著提高酶的稳定性和催化活性。
胰蛋白酶作为一种具有较强特异性的水解蛋白酶，在生物体中的催化作用十分显著。但是，一般从牛、羊、猪胰脏中提取出来的胰蛋白酶为游离态的，反应条件比较苛刻。因此本实验选择新型杂化纳米花的方法，选择磷酸钙作为无机组份来固定胰蛋白酶，从而提高胰蛋白酶的稳定性与催化活性。
2、筛选制备酶晶体的最适条件
在进行胰蛋白酶固定时，制备酶晶体的适宜条件还不太确定，因此需要设计实验筛选出最适的制备条件。Lin等人[9]从纳米花的微观形貌的角度分析和研究了不同酶浓度（0-3 mg·m L-1）对杂化纳米花的影响。他们借助扫描电镜分析发现，酶浓度会影响纳米花的微观形貌和大小。随着过氧化物酶浓度的增加，破碎的“花瓣”会逐渐形成多层花状的结构，而且由于纳米花的晶核数量会逐渐增加，导致纳米花的的直径减少。Wang等人[10]研究发现，当磷酸盐浓度较低（lt;10mM）时，有利于杂化纳米花的形成，此时酶的负载量较高。但是当磷酸盐缓冲液的浓度较高（gt;15mM）时，却生成了杂化纳米薄片。所以，可能是纳米晶体结构的不同导致了上述的现象的差异。张腾江[11]在进行beta;-葡萄糖醛酸苷酶-CaHPO4杂化纳米花的制备时，由于纳米花在酸性溶液中不能稳定存在，随着溶液pH值的增加，生成纳米花的量和酶的负载量逐渐增加。但是相对酶活却随着pH的增加，先升高后降低，当溶液pH值为6.5时，相对酶活达到最大值。根据上述研究，本实验在制备固定化胰蛋白酶时，选择酶浓度、PBS缓冲液的pH和浓度作为研究对象，筛选出最适宜制备固定化胰蛋白酶的条件。
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