植物来源的倍半萜合酶的突变改造
摘要：倍半萜合酶是一类通过替代途径催化法尼焦磷酸（FPP）环化，产生多种环状倍半萜产物的酶。根据最新研究发现，定点诱变实验已经表明AS的Tyr92是负责在FPP转化为花青烯的过程中大根香豆烯A的质子化的活性位点酸。在研究合成烟草-花椒烯合酶（TEAS）的中间体吉玛烯A合酶过程中，通过Y520F突变成功并入TEAS，使用含有TEAS的 cDNA作为模板，然后利用pET28b表达构建体.206组氨酸标记的TEAS-Y520F蛋白的表达与未突变TEAS作比较，结果发现用任何蛋白质的镍亲和纯化产生约3.5mg蛋白质/ 100mL培养物，相对于未突变的TEAS，Y520F突变导致FPP的KM增加3.5倍。对DDxxD基序的第一天冬氨酸的诱变导致对于d-硒烯合酶的抑制的kcat，对Km的影响较小，并且提供了主要由单环烯烃组成的更简单的产物谱。 c-葎草烯合酶的相同改变产生了类似的动力学效应与简单的产品光谱的大部分无环和单环烯烃。虽然产品多样性受损，但没有突变型合成酶丢失完全是产生复杂结构的能力。这些结果证实了DDxxD基序的催化重要性并暗示它们还影响允许的环化模式。
关键词：萜烯合酶； 倍半萜； 基因突变；倍半萜合酶
一、文献综述
倍半萜合酶
倍半萜是从植物，真菌，细菌和海洋无脊椎动物中分离出来的结构最多样化的天然产物之一.12它们被认为在植物抵御敌人，吸引传粉者，并在每个其他。迄今已知的数万倍半萜类化合物衍生自倍半萜产生的300个碱性烃骨架。
使用法尼基二磷酸（1，FDP）作为底物的环化酶（合酶）。这些酶产生的产物的多样性可以显着不同。除了高保真酶之外，例如，释放单一产物的来自Gossypium arboreum4的delta;-桉树素合酶，存在已知合成的多重酶多达52种不同的产品。5,6不同选择性的结构基础被认为是活性位点的三维轮廓的结果，允许或拒绝反应性阳离子中间体的不同构象。然而，产物的结构和立体化学被认为主要由底物的正确折叠和阳离子中间体与活性位点的氨基酸的静电相互作用决定。 9反应级联是通过金属离子介导的二磷酸基团从底物裂解而引发，导致高度反应性的碳阳离子。该反应中间体可以进行不同的环化和重排，例如氢化物和甲基转移。产物通过消除质子或在与水反应后释放倍半萜醇.10萜烯合酶也能够产生酶结合的中性中间体再生后进一步环化。
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