血浆直扩技术的研究及其在cffRNA检测中的应用文献综述

 2022-11-04 10:29:19

文献综述（或调研报告）：

早在1989年，研究者就发现孕妇外周血液中存在胎儿DNA信息。1997年，丹尼斯等首次证实孕妇血浆中存在胎儿DNA的事实。随着无创性产前诊断的进一步发展，Leo LM Poon， Tse N. Leung， Tze K. Lau， YM Dennis Lo[1]等人于2000年首次证明携带男性胎儿的孕妇血浆中存在胎儿来源的雄性特异性mRNA。因此，随着其他RNA标记物的开发，母体血浆RNA分析可以允许在多种生理和病理条件下非侵入性地监测胎儿基因表达。目前对血浆中游离RNA的提取已有成熟的技术和方法，但大多需要依靠试剂盒进行。这一步骤，不仅耗费大量的时间和金钱，也进一步加大了样本交叉污染的可能。同时RNA的提取需要大量的样本，提取过程中也会有一部分损失，极不利于一些珍贵样本的研究。因此直接对全血进行RT-PCR而无需任何RNA提取将是非常有益的。然而，直接用血液进行RT-PCR扩增是非常困难的，因为血液中的某些物质可能会干扰细胞裂解或使热稳定的DNA聚合酶失活。另外，抗凝血剂，如EDTA二钾或肝素，可以干扰PCR扩增。为了克服PCR抑制，提高检测灵敏度并简化检测方案，我们旨在开发一步RT-PCR的简单方法，直接从大量全人血液中检测RNA。目前已有研究证明Thermus thermophilus（Tth）聚合酶对几种常见的PCR抑制剂具有抗性，并且在锰离子存在下表现出逆转录酶活性。结合优化的Mg2 和Mn2 浓度，Tth聚合酶能够有效检测来自用各种抗凝血剂处理的大量WHB的DNA，但大量WHB的直接RNA检测尚未见报道[2]。此外，为了便于从血液样品中直接PCR扩增，静电相互作用应该有效地抑制蛋白质和核酸之间的差异,Ying Bu，Huan Huang，Guohua Zhou等人已经通过使用更高的pH缓冲液来减弱抑制剂和基因组DNA之间的相互作用，从而直接从血液中扩增DNA[3]。本课题希望通过设计交叉实验，能够探究出血浆直接扩增RNA的合适反应条件，包括Mg2 和Mn2 浓度、缓冲液PH值、不同Taq DNA poI的比较、血浆不同保存条件等，并且能够将方法实际应用到孕妇外周血中游离胎儿RNA的提取与鉴定中。

参考文献：

  1. Leo LM Poon， Tse N. Leung， Tze K. Lau， YM Dennis Lo.Presence of fetal RNA in maternal plasma[j].Clinical Chemistry,2000,46(11)
  2. Dongyang Cai, Ole Behrmann, Frank Hufert, Gregory Dame amp; Gerald Urban.Direct DNA and RNA detection from large volumes of whole human blood[J]. Nature, 3410 (2018)
  3. Ying Bu，Huan Huang，Guohua Zhou. Direct polymerase chain reaction (PCR) from human whole blood and filter-paper-dried blood by using a PCR buffer with a higher pH[J]. Analytical Biochemistry,2008,375(2):370-372

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