姓名

常秀锦

学号

2020171125

专业

制药工程

指导教师

卞金磊

课题名称

基于肿瘤能量代谢通路的谷氨酰胺酶共价变构抑制剂的设计合成及生物活性评价

课题性质

radic;基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题背景

Warburg效应指出：与正常细胞相比，肿瘤细胞更趋向于将葡萄糖进行有氧糖酵解，即将葡萄糖代谢为乳酸，排出细胞外，而导致经由三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle, TCA）产生的代谢物明显减少^[1]。因此，单纯糖酵解过程已经不能满足肿瘤细胞生长增殖所必需的能量供应，为维系三羧酸循环的运行，就必须通过其它途径进行有效补充，即“回补效应”。研究发现谷氨酰胺水解产生的谷氨酸可转化为alpha;-酮戊二酸（alpha;-Ketoglutaric Acid, alpha;-KG），进入三羧酸循环，是回补反应中最为重要的途径。大量研究表明，谷氨酰胺代谢在肿瘤细胞中异常活跃，对维持肿瘤细胞生长、增殖、转移起着至关重要的作用^[2]。

大量实验表明：生长中的肿瘤细胞对谷氨酰胺高度依赖^[3]，一旦谷氨酰胺被剥夺，肿瘤细胞的生长增殖则会立刻受到抑制^[4]。在整个代谢途径中，谷氨酰胺酶（glutaminase， GLS）的过度表达满足了这一要求，GLS催化了谷氨酰胺代谢的第一步，而且是关键限速步骤，因此是一个潜在的治疗靶点。

谷氨酰胺代谢通常依赖于线粒体谷氨酰胺酶（GLS）活性，它将谷氨酰胺转化为谷氨酸，并在生物能量过程中起着重要作用^[5]。在哺乳动物体内，谷氨酰胺酶主要分为两种亚型：肾型谷氨酰胺酶（kidney-type glutaminase, GLS1）和肝型谷氨酰胺酶（liver-type glutaminase, GLS2）。GLS1又可以分为两种剪切异构体：GAC（glutaminase C） 和 KGA（kidney-type glutaminase） ^[6,7]。在许多肿瘤细胞系和原发肿瘤中， GLS1基因过表达，而GLS2基因在肿瘤中的表达不广泛^[8]。 在不同的肿瘤模型中使用有效的GLS1抑制剂治疗，或通过基因沉默GLS1验证了GLS1作为治疗靶点^[9-13]。

1. 要解决的问题

肿瘤发生及癌细胞増殖与代谢重编程密切相关。研究发现，许多肿瘤细胞具有“谷氨酰胺成瘾”这一特性，在靶向药物治疗时肿瘤细胞谷氨酰胺代谢代偿性増强，可能是肿瘤产生耐药的一个潜在因素。而靶向共价抑制疾病相关蛋白是药物发展领域的一种强有力手段。本课题基于谷氨酰胺酶的结构，以进入临床试验的谷氨酰胺酶变构抑制剂CB839为先导化合物，期望发现新型结构，兼具活性及成药性的优势候选化合物，为肿瘤能量代谢治疗提供新的思路和策略。

1. 可行性分析

GLS-1抑制剂按照作用机制主要分为两类：一类是底物位点抑制剂，另一类是变构位点抑制剂。

底物位点抑制剂主要包括： DON, azaserine和acivicin^[14,15]。这类抑制剂在结构上大多是谷氨酰胺的类似物。其除了可以抑制GLS-1的活性外，还表现出对其它酶的抑制作用。因此，这类抑制剂在体内的毒性和副作用较大，限制了其临床发展^[16,17,18]。

变构位点抑制剂主要包括：BPTES，CB839等。2007年，通过高通量筛选的方式得到了第一个GLS-1变构位点抑制剂BPTES^[19,20]。BPTES表现出对GLS-1很好的活性和选择性，其对GLS-1的抑制活性IC₅₀为3.3 mu;M。但是，由于其理化性质和成药性太差，因此，其体内活性不佳。后面，针对这一问题，研究人员对BPTES进行了大量的衍生化和构效关系研究。最终找到了一个活性和成药性均还可以的小分子GLS-1抑制剂CB839。其对GLS-1的抑制活性IC₅₀为30 nM，在体内也表现出一定的抗肿瘤作用。

图1. 代表性GLS-1抑制剂。（A）底物位点抑制剂；（B）变构位点抑制剂

尽管GLS-1抑制剂在治疗谷氨酰胺依赖性的肿瘤方面有着一定的作用和治疗前景。但是，目前可以用于临床研究的GLS-1抑制剂只有CB839和IPN-60090，数量太少且药物骨架单一。而且，目前CB839大部分的临床试验是以联合给药的方式开展。这种种问题，给GLS-1抑制剂的发展带来了瓶颈。因此，急需发现具有全新骨架的、兼具活性和成药性的GLS-1抑制剂，为临床研究提供更多的选择。

1. 研究方法和内容

稳定、合理的代谢稳定性对于药物开发是必不可少的条件之一^[21,22]。我们首先对筛选得到的化合物 C147 （图2）进行了体外肝微粒体稳定性考察，CB839 作为阳性对照。

图2. 化合物C147结构

如图3所示，在体外与人源的肝微粒体酶 30 min 和 60 min 孵育后， C147（蓝色）的剩余量分别为：56%和 35%，均低于同等条件下的 CB839。经过计算，C147 的体外清除率为 40.01 micro;L/min/mg，是 CB839 的两倍（18.5 micro;L/min/mg）；C147 的半衰期为 40.56 min，明显低于 CB839（94.79 min）。以上结果表明，C147 的体外肝微粒体代谢清除率较高，半衰期较短，不利于进行后续更深入的体内药效学考察，有待进一步结构改造与优化。

图3. 化合物C147体外肝微粒体代谢稳定性实验结果

对化合物 C147 分子结构进行深入地剖析，我们猜测：可能是由于 1,2,3-三氮唑环的引入，导致化合物整体电子云密度过高，从而其结构中间四个碳原子的 脂肪连接链 linker 更容易被氧化代谢。因此，我们将主要围绕 C147 结构中易被代谢位点进行修饰改造。我们首先设想将中间易被代谢的脂肪链 linker 用饱和的、相对柔性的、不易被代谢的脂肪环替换。对 linker 考察的同时，我们对 C147 结构中的活性必需基团左侧“head”芳香环 R1（图4），中间“body”linker 右边的哒嗪环 R2、以及三氮唑环右侧“tail”基团 R3 也进行了等效替换，期望可以获得兼具活性以及代谢稳定性的优势组合化合物。

图4. “head”、“body”、“tail”基团示意图

第 I 类(R)-3-氨基吡咯烷化合物： 第 I 类化合物采用空间位阻较小、具有手性的五元脂肪环(R)-3-氨基吡咯烷作为中间 linker。

表1 (R)-3-氨基吡咯烷类化合物结构

第 II 类(S)-3-氨基吡咯烷化合物： 我们推测 3-氨基吡咯烷结构中碳原子的手性可能会对化合物的空间构型有一定的影响，从而影响化合物与 GLS1 蛋白的相互作用。因此，我们又设计了第 II 类(S)-3-氨基吡咯烷化合物，作为第 I 类化合物的手性异构体，考察手性对活性的影响。

表2 (S)-3-氨基吡咯烷类化合物结构

第 I 类中间 linker 为(R)-3-氨基吡咯烷的目标化合物LC101~LC104，具体合成路线如 Scheme 1, 2 所示。

以(R)-3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷（1-R）为起始原料，和 2-氨基-5-溴-1,3,4-噻二唑发生取代取代反应，生产中间体 2，进而再和戊炔酸发生缩合反应，生成中间体 3。在三氟乙酸的作用下，脱去 Boc 保护基，再分别和一分子的 2-氨基-5-溴-1,3,4-噻二唑发生取代反应，和苯乙酸发生缩合反应，生成关键炔烃中间体 6。最后，在碘化亚铜和微波的条件下，中间体 6 分别和不同取代基的优势叠氮基团发生快速地点击反应，生成对应的目标终产物 LC101~LC102。

Scheme 1 化合物LC101~LC102的合成。Reagents and conditions: (a) 2-amino-5-bromo-1,3,4-thiadiazole, TEA, n-butyl alcohol, 180 ℃, 1.5 h; (b) 4-pentynoicacid, HATU, DIPEA, TEA, DMF, rt, 1 h; (c) DCM, TFA, rt, 4 h; (d) NaHCO₃, EtOH, 80 ℃, reflux, 4 h; (e) Phenylacetic acid, HATU DIPEA, TEA, DMF, rt, 10 min; (f) CuI, azides, microwave 300 W, 100 ℃, 2 min.

目标化合物 LC103~LC104 的合成（Scheme 2）类似于上述的 Scheme 1。同样是以(R)-3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷（1-R）为起始原料，用 3-氨基-6-氯-哒嗪替换上述的 2-氨基-5-溴-1,3,4-噻二唑，依次通过取代反应、缩合反应、水解脱 Boc、再缩合反应、取代反应生成关键炔烃中间体 11。最后，在碘化亚铜和微波的条件下，中间体 11 分别和不同取代基的优势叠氮基团发生快速地点击反应，生成对应的目标终产物 LC103~LC104。

Scheme 2 化合物 LC103~LC104 的合成。 Reagents and conditions: (a) 3-amine-
6-chloro-pyridazin, TEA, n-butyl alcohol, 180 ℃, 1.5 h; (b) 4-pentynoicacid, HATU, DIPEA, TEA, DMF, rt, 1 h; (c) DCM,TFA, rt, 4 h; (d) NaHCO₃, EtOH, 80 ℃, reflux, 4 h; (e) 2-pyridineacetic acid hydrochloride, HATU DIPEA, TEA, DMF, rt, 10 min; (f) CuI, azides, microwave 300 W, 100 ℃, 2 min.

第 Ⅱ 类中间 linker 为(S)-3-氨基吡咯烷的目标化合物LC201~LC204，具体合成路线如 Scheme 3, 4 所示。

目标化合物 LC201~LC202 的合成（Scheme 3）类似于上述的LC101-LC102（Scheme 1）。将起始原料由(R)-3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷（1-R）替换成(S)-3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷（1-S），其它反应试剂、反应时间、反应温度等条件与 Scheme 1 基本保持一致。

Scheme 3 化合物 LC201~LC202 的合成 。 Reagents and conditions: (a)
2-amino-5-bromo-1,3,4-thiadiazole, TEA, n-butyl alcohol, 180 ℃, 1.5 h; (b) 4-pentynoicacid, HATU, DIPEA, TEA, DMF, rt, 1 h; (c) DCM, TFA, rt, 4 h; (d) NaHCO₃, EtOH, 80 ℃, reflux, 4 h; (e) Phenylacetic acid, HATU DIPEA, TEA, DMF, rt, 10 min; (f) CuI, azides, microwave 300 W, 100 ℃, 2 min.

目标化合物 LC203~LC204 的合成（Scheme 4）类似于上述的LC103~LC104（Scheme 2）。将起始原料由(R)-3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷（1-R）替换成(S)-3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷（1-S），其它反应试剂、反应时间、反应温度等条件与 Scheme 2 基本保持一致。

Scheme 4 化合物 LC203~LC204 的合成。 Reagents and conditions: (a) 3-amine-
6-chloro-pyridazin, TEA, n-butyl alcohol, 180 ℃, 1.5 h; (b) 4-pentynoicacid, HATU, DIPEA, TEA, DMF, rt, 1 h; (c) DCM, TFA, rt, 4 h; (d) NaHCO₃, EtOH, 80 ℃, reflux, 4 h; (e) 2-pyridine acetic acid hydrochloride, HATU DIPEA, TEA, DMF, rt, 10 min; (f) CuI, azides, microwave 300 W, 100 ℃, 2 min.

1. 工作计划

2月28日—3月20日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。

3月21日—5月10日：完成对LC101~LC104及LC201~LC204的合成，并从分子水平探讨其构效关系。此外，还将采用MTT以及蛋白热迁移等测试手段对所获得的谷氨酰胺共价变构抑制剂进行抗肿瘤活性研究工作。

5月11日—5月20日：完成毕业论文的撰写工作。

5月21日—6月04日：完成毕业论文的评阅、答辩与修改工作。

6月05日后：完成毕业论文的校对、归档等工作。

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学生签名： 年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

指导教师所在教研(研究)室审查意见：

负责人签名： 年 月 日