基于肿瘤能量代谢通路的谷氨酰胺酶大环抑制剂的设计合成及生物活性评价文献综述

1.论文的背景、目的和意义

1.1 研究的背景

肿瘤代谢途径相关酶作为肿瘤的治疗是近些年的研究热点。肿瘤代谢是肿瘤获取生殖能量和生物合成的重要途经，除了葡萄糖，谷氨酰胺也是重要的物质。谷氨酰胺代谢促进肿瘤细胞的生长，为其提供能量，维持胞内氧化还原平衡，以及促进生物大分子的合成。故而，谷氨酰胺作为肿瘤的条件性必须氨基酸，对肿瘤具有很大的影响，研究表明，许多肿瘤细胞具有“谷氨酰胺成瘾”的特性。

1.2 目的和意义

研究谷氨酰胺酶的抑制剂，发现特异性进攻GLS1靶点且具有抗肿瘤活性的化合物，抑制谷氨酰胺代谢，从而抑制肿瘤的生殖和生物合成。实现靶标的亲合力，蛋白降解的活性以及类药物性质和安全性质的平衡。以期最后得到高效的GLS1抑制剂。

2.国内外研究概况

2.1 谷氨酰胺酶抑制剂的研究进展

目前研究较多的为谷氨酰胺代谢酶类及其转运体的抑制剂。最早发现的谷氨酰胺酶的抑制剂是非竞争性抑制剂，其为谷氨酰胺的类似物6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（DON）和重氮丝氨酸。但其拮抗作用会引起严重的毒副作用，而且抗肿瘤的活性也比较有限，所以局限了它的利用。

化合物968（5-（3-溴-4-（二甲基氨基）苯基）-2，2-二甲基-2，3，5，6四氢苯并［a］菲啶-4（1H）-酮）是GLS1的特异性抑制剂，抑制GLS1的重组表达。通过和未被激活的谷氨酰胺酶结合，来阻止GLS1的活化。

BPTES（双-2-（5-苯基乙酰氨基1，3，4-噻二唑-2-基）乙基硫醚）是有效的，非竞争性的特异性GLS1抑制剂。它的作用机制是通过与谷氨酰胺酶结合，从而使靠近催化位点的关键环发生强烈的构象变化来抑制谷氨酰胺酶的活性。化合物968和BPTES的毒副作用相比之前的抑制剂明显减小，所以被广泛的应用于临床前的研究。

CB-839是BPTES结构基础上的抑制剂，具有更强的抗肿瘤活性。CB-839是新型可逆的非竞争性谷氨酰胺酶抑制剂。此外，联合使用谷氨酰胺酶抑制剂和其他的抗代谢药物可以获取更佳的抗肿瘤效果。例如联合使用GLS1抑制剂和mTOR抑制剂以及在肺癌中联合使用BPTES和5-FU可以产生很好的抗肿瘤效果。以下是谷氨酰胺酶抑制剂。

3.论文的理论依据、研究方法、研究内容

3.1 谷氨酰胺酶抑制剂的理论基础和依据

3.1.1 谷氨酰胺酶的生理基础

谷氨酰胺酶（GLS）分为GLS1和GLS2。GLS1称为肾型GLS，而GLS2称为肝型GLS，它们是位于不同染色体的独立的基因编码。GLS1在多种癌症类型中过表达，而GLS2能够抑制肿瘤细胞的生长。GLS1有KGA、GAC 和 GAM三种亚型，但GAM不具有催化的活性，目前倾向于GAC为主要的亚型，其中KGA存在除肝外的所有组织，尤其是在肾、脑、肠上皮、淋巴细胞的含量丰富，GAC 主要存在于心肌和胰腺组织中。以下是GLS1。

GLS2有CAB和LGA两种亚型。有研究发现脑，胰腺以及乳腺癌细胞等肝外组织有LGA。不同GLS的亚型在组织的发布是不同的，具有组织特异性。不同组织类型的肿瘤，甚至于同种肿瘤类型的不同亚型，GLS的表达模型也不完全相同。

3.1.2 谷氨酰胺的代谢

谷氨酰胺由其主要转运体丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体2 （ASCT2）从细胞膜转运进入细胞后，线粒体上的GLS催化谷氨酰胺反应产生谷氨酸（Glu）和氨。谷氨酸在谷氨酸脱氢酶的作用下转化为ɑ-酮戊二酸（ɑ-KG），然后进入三羧酸循环，此过程为谷氨酰胺酵解，此过程为“Warburg效应”。肿瘤细胞为了维持能量需求，在有氧的情况下会大量的酵解葡萄糖产生ATP。从而导致进入三羧酸循环的底物减少，但要满足合成生物大分子的需求，癌细胞会摄入大量的谷氨酰胺。多种肿瘤细胞具有“谷氨酰胺成瘾”的性质。由此，我们可以把GLS作为靶点进行肿瘤的治疗。

3.1.3 谷氨酰胺酶抑制剂的抗肿瘤机制

利用饥饿作用，通过抑制肿瘤细胞对谷氨酰胺的摄取，阻碍其能量来源和生物大分子合成。合成谷胱甘肽以及NADPH的重要前提物质是谷氨酰胺，其保护了癌细胞免受于活性氧ROS的破坏，同时还维持了细胞内外环境的氧化还原稳态。所以GLS抑制剂破坏细胞内外的氧化还原稳态也可以实现抗肿瘤的效果。癌信号cMyc、Ras等和谷氨酰胺代谢密切相关，故而GLS抑制剂可以通过影响癌基因来调节肿瘤的信号传导通路。GLS抑制剂还可以抑制细胞的自噬，从而阻碍了肿瘤细胞的生存和生长。

3.1.4 GLS1抑制剂和GLS1构象

对BPTES和GLS1的共晶结构研究后发现，两者结合以后出现“U型”的折叠构象。其中噻二唑酰胺部分与苯丙氨酸322和异亮氨酸323形成氢键，两个末端苯环间位碳原子的距离为17.13 Aring;。

4．谷氨酰胺酶抑制剂的研究方法、研究内容

4.1谷氨酰胺酶抑制剂的研究方法

利用“生物正交化学”的策略来改善GLS1抑制剂类药性的性质，对化合物的空间结构和官能团等进行优化，探索合成具有高效的靶点进攻性和强大的生物活性的化合物。采用MTT以及蛋白热迁移等测试手段对所获得的谷氨酰胺共价变构抑制剂进行抗肿瘤活性研究。

4.2 谷氨酰胺酶抑制剂的研究内容

（1）目标化合物（单环类大环化合物）的合成路线

噻二唑环类：

Rengents and conditions: (i) Thiosemicarbazide, POCl3, 110oC, 5h; (ii) HATU, DIEA, DMF, room temperature, 4h; (iii) 2N NaOH, MeOH, rt, 10h; (iv) Thiosemicarbazide, POCl3, 110oC, 5h; (v) HATU, DIEA, DMF, room temperature, 4h; (vi) Hoveyda-Grubbs, THF, 50oC, 5h;

哒嗪环类：

Rengents and conditions: (i) HI, 50 oC, 32 h; (ii) Thiosemicarbazide, POCl3, 110 oC, 3 h; (iii) (Boc)2O, TEA, DCM; (iv) Pd(PPh3)4, CuI, TEA, 60 oC, 3 h; (v) H2, Raney Ni, 48 h; (vi) HATU, DIPEA, DMF, room temperature, 8 h; (vii) DCM, TFA, 15h; (viii) HATU, DIPEA, DMF, room temperature, 2 h; (ix) Hoveyda-Grubbs, THF, 50 oC, 3 h.

（2）生物活性测试

①大环类GLS1抑制剂的体外GLS1抑制试验

试验目的：确证待测化合物是否是通过作用于GLS1，从而阻断谷氨酰胺代谢来影响肿瘤细胞生长生殖。

试验原理：GLS1蛋白将其底物谷氨酰胺水解为谷氨酸之后，谷氨酸会在谷氨酸脱氢酶的催化下，将氢原子转移到 NAD 上生成 NADH，检测 NADH在340 nm下的吸光度，从而反映 GLS1 蛋白的活性。

②大环类GLS1抑制剂的蛋白热稳定性迁移试验

实验目的：考察小分子化合物和谷氨酰胺酶GLS1蛋白之间的相互作用。确证抑制剂是否是直接作用于GLS1蛋白。

以下为实验过程：

③大环类GLS1抑制剂在体外对肿瘤细胞增殖抑制试验

试验目的：观察供试化合物对肿瘤细胞的增殖抑制作用。研究机制表明：三阴性乳腺癌MDA-MB-436细胞和结肠癌HCT116细胞对于谷氨酰胺高度敏感，过分依赖谷氨酰胺维持细胞的生长和生殖，呈现出“谷氨酰胺成瘾性”。同时，肿瘤基因图谱表明：MDA-MB-436和HCT116细胞的谷氨酰胺酶GLS1基因水平和蛋白水平高度表达，而且GLS1表现出很强的酶活性。因此，化合物对这两株细胞的增殖抑制作用可以体现所设计的化合物是通过抑制GLS1从而达到抗肿瘤细胞增殖的作用。

5.预期结果

（1）合成5-10个代表性化合物进行生物学验证。

（2）采用MTT以及蛋白热迁移等测试手段对所获得的谷氨酰胺共价变构抑制剂进行抗肿瘤活性研究。

6. 论文工作时间安排

2021.3月：

1、查找文献，学习柱层析分离、薄层层析分离、TLC监测反应进程、蒸馏、常规溶剂处理、蒸馏，以及旋转蒸发仪等相关仪器的使用及注意事项，开始大环化合物中间体合成。

2、撰写开题报告，并提交开题报告。

2021.3——4月：

1、在中间体的基础上，探究成环的合成方法，学习烯烃复分解的无水无氧操作，不断优化设计反应条件，得到目标化合物。

2、将目标化合物采用核磁、质谱、红外、元素分析等方法确证并表征结构。将合成化合物稳定保存。

2021．4——6月：

1、将取得的目标化合物进行酶活测试，从而选取代表性的肿瘤细胞株，采用MTT法评价目标化合物的体外抗肿瘤活性。选取活性较好的化合物，进行分子水平的评价。

2、对项目的整体进展情况进行总结，总结成果，撰写论文，规范论文格式，校对，定稿。

3、准备毕业答辩。

7.参考文献

[1] Thangavelu K, Pan, C Q, Karlberg T, et al. Structural basis for the allosteric inhibitory mechanism of human kidney type glutaminase (KGA) and its regulation by Raf-Mek-Erk signaling in cancer cell metabolism [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109 (20): 7705-7710.

[2] Xu X, Meng Y, Li L, et al. Overview of the development of glutaminase inhibitors: achievements and future directions[J].J Med Chem,2018,doi:10.1016/j.bioorg.2018.08.028.

[3]李丹云,牛培广,史道华.基于谷氨酰胺代谢抗肿瘤药物的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学,2020,25(07):810-816.

[4]黎兵华,丁义涛,余德才.谷氨酰胺酶与肿瘤的关系研究进展[J].转化医学电子杂志,2017,4(12):1-6.

[5]廖英,冀林华,崔森.谷氨酰胺酶新型抑制剂及其抗肿瘤活性研究进展[J].中国肿瘤临床,2019,46(07):366-369.