课题意义和价值：目前，重组单克隆抗体大多数是采用哺乳动物细胞表达系统进行生产，在产品的生产，存储，运输等过程中，往往会发生产品的聚集、讲解及各种翻译后修饰，从而导致产品分子大小、电荷、糖基化修饰等不均一性及其相应的变体产生。人用重组单克隆抗体是一种具有复杂的翻译后修饰的生物大分子，它的微观不均一性导致单克隆抗体药物并不是单一纯净的物质，而是多种产品相关物质的混合物，这对单抗的稳定性和生物活性有重要影响，影响治疗效果或者产生新的副作用，因此对这些单抗产品相关的变体及其降解方式的进一步研究很重要。几乎所有的变体均能导致抗体表面电荷分布产生差异。电荷变量因此成为监测抗体降解最灵敏的方式，也是对产品质量一致性分析的一项重要参考标准。
本课题拟解决的问题:鉴定单克隆抗体电荷异质体，对其变体和降解方式进行研究，探究变体产生原因，并对如何减少变体的产生提出意见。
文献综述
1.单抗电荷异质体定义：单抗分子发生翻译后修饰以及降解，如:末端的改变，糖基化，脱酰胺基作用，氧化，分裂，聚合等，这些修饰几乎都会引起单抗表面电荷的改变，导致生成电荷变体。这就是单抗的电荷异质性。
2.电荷异质体的成因：与主峰相比，这些变异体通常被称为酸性变异体和碱性变异体，即酸峰和碱峰，采用CEX分析时，酸峰早于主峰洗脱出来，而碱峰晚于主峰洗脱出来。如:N末端谷氨酰胺／谷氨酸环化，在CEX监测中，Q环化表现为酸峰，而E环化则是中性的，这是因为在谷氨酸环化时各产生一个酸性和碱性基团；天冬酰胺脱酰胺化和天冬氨酸异构化，也是单抗电荷异质体的一种成因，天冬酰胺脱酰胺化通常为酸峰。单抗天冬酰胺脱酰胺化位点主要有两处:CDRs和Fc端的肽段，而天冬氨酸异构化的位点还没有明确，但在CDRs已发现天冬氨酸的异构化，，CDRs区域及N387，N389位的天冬氨酸脱酰胺化形成酸性峰，但中间产物琥珀酰亚胺的不完全水解(碱性环境下利于水解)会导致碱峰的产生；N糖基化是蛋白在酶的作用下被连接上糖链的过程，不同的糖基转移酶会在Fc段末端分别添加岩藻糖，半乳糖，甘露糖，或者唾液酸，使抗体呈现特异性，带走唾液酸修饰的抗体出现在主峰前的酸变体洗脱峰中；氧化在蛋白质中很常见，主要发生在甲硫氨酸，半胱氨酸，组氨酸和色氨酸，在人IgG1单克隆抗体中已发现的2个甲硫氨酸氧化点分别是Fc段上的M252和M428，这两个为敌的那均可在过氧化氢紫外线等条件下氧化，这两个位点氧化后，疏水性减弱，在CEX法中作为碱性变体被检测到；单克隆抗体具有多个链内和链间二硫键。人IgG的4种亚型的不同就在于链间二硫键桥的数量和空间结构不同，未配对和配错的二硫键均会引起抗体结构的变异，从而导致抗体表面电荷分布发生改变。还有分子片段和聚合都会对抗体表面电荷分布产生影响甚至是改变结构。在单克隆抗体生产的过程中，为了达到产品的安全、有效、质量可控。一般对变体采取的控制策略有一下这些方式：控制培养时间，减少生成变体，控制培养温度，培养PH，渗透压，控制培养液中某些成分来控制修饰程度。
3.电荷异质体对单抗的结构和活性的影响：一般来说，发生在N/C端的修饰，对与效价，和结构和稳定性没有影响。在Fc片段的修饰，比如说氧化，对于效价没有影响，但是对于结构与稳定性有影响。而在Fab片段上的修饰，对效价和结构与稳定性均有影响从而可同时影响安全性和有效性。比如说存在Fab功能区的聚糖，高水平的唾液酸化修饰导致抗体与Fcgamma;RⅢa的亲和力降低，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)活性减弱。虽然有些原因不会影响单抗效价和结构，但是保证电荷异质体的一致性对单抗的生产同样重要。特别是当电荷变异值接近或超过1个PI单位时，会影响药物的组织分布和药代动力学。
4.CEX-HPLC原理
CEX: cation-exchange chromatography 阳离子交换色谱，在CEX-HPLC色谱柱中带正电性分子被带负电性的固定相吸附。因为不同电荷异质体带有不同电性，带负电性蛋白分子会被首先洗脱出来，接着是中性的主峰，最后才是带正电性的蛋白分子。由此生成酸峰，主峰，碱峰。
本课题采用的研究手段：本次实验通过离子交换的方式(CEX-HPLC)进行电荷变异体的分析，并且收集各个组分，并对收集到的组分分别进行相应的鉴定。
本课题实行方案及进度:
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