背景：
细胞毒性（Cytotoxicity）是由合成化合物、免疫调节细胞(如细胞毒性T淋巴细胞，自然杀伤细胞等)或药物等作用于细胞基本结构和生理过程，如细胞膜、细胞器或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放及细胞分裂等过程，导致的细胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制现象。按作用机制可分3种类型：基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现，毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑[1]。研究显示,化合物或药物的体外细胞毒性数据与其引起的动物死亡率以及引发机体死亡的血药浓度等体内数据之间存在有良好的相关性[2,3]。Casati等利用毒理学和统计学工具，将不同检测终点、不同组织和种属的体外细胞毒性实验数据与在体实验的结果拟合，利用拟合方程对在体实验结果进行预测，并与真实实验结果相对比,发现啮齿动物细胞系对啮齿动物急性毒性,人源细胞系对人体急性毒性均有良好的预测能力[4]，所以体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。细胞毒实验可以用于评估药物的有效性、毒性、耐药性、药物对细胞凋亡、增殖等作用的影响，同时还可以应用于评价医疗器械和生物材料等的致细胞毒性反应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应，可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了判定条件，能够有效地减少实验动物的使用[5]，在药物的研发过程发挥重要作用。
研究者已经开发多种方法用于评价细胞毒性，常用的方法是测定化合物或药物加入后细胞的存活与增殖情况，其中，比较经典的方法是利用活细胞的线粒体呼吸链还原显色，如四甲基偶氮唑盐（MTT）法[6,7]、MTS法[8]、WST-1法[9]、XTT法[10]、CCK-8（Cell Counting kit-8）法[11]和刃天青染色法[12],[13]等，其他的评价方法有检测细胞内容物释放的利用腺苷酸激酶（AK）的荧光素发光法和利用乳酸脱氢酶（LDH）的乳酸脱氢酶释放法、基于中性红染色的组织琼脂扩散实验[14]、基于非特异性水解酶染色的滤过扩散实验[15]、基于锥虫蓝染色的细胞计数法[16,17]、结晶紫染色法(crystal violet staining,CVS)[18]和中性红摄取比色法(neutral red uptake, NRU)[19]等。在这些方法中，MTT法是比较常用的一种方法。
自1983年Mosmann建立MTT比色法[6]以来，由于其简单经济、操作方便和重复性好,无放射性污染等特点，MTT法已经成为细胞生物学领域测定细胞生长及增殖情况的常用方法。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide，MTT]是一种接受氢离子的染料,呈黄色，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链, 在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下 ,外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量，在一定细胞数范围内,甲瓒结晶形成的量与活细胞数成正比，通过这一方法可以较为准确地评价化合物或者药物的细胞毒性。但是，不可否认的是这一方法仍有其缺点：细胞毒性较大,经MTT处理后的细胞不能继续培养;结果易受还原剂、呼吸链抑制剂、培养基条件和细胞内嘧啶核苷酸的影响，如Vladimir等人检测到在没有细胞存在的情况下MTT的浓度依赖性反应[20];并非所有的细胞都能代谢MTT等[21]。这要求实验者关注这一实验原理，用更严谨的实验设计如采用阳性对照等方法来排除其他因素对于实验结果的影响。
GB冻干粉是一款多肽类产品，利用MTT法可以研究其对呼吸道和消化道相关代表性上皮细胞株包括人口腔角质细胞HOK、人鼻腔上皮细胞RPMI2650、人支气管上皮细胞Beas-2B、人支气管上皮细胞HBE、人肺成纤维上皮细胞HPF、人肺泡上皮细胞HPAEpiC、人食道正常上皮细胞HEEC、人胃粘膜正常上皮细胞GES-1、人小肠上皮细胞FHs74Int和人正常结肠上皮细胞CCD-841CoN在内的10种细胞的细胞毒性，通过对不同浓度组的吸光度的计算可以得出不同GB原液浓度下不同细胞的细胞相对增殖率（Relative growth rate, RGR）：
美国药典根据RGF将细胞毒性分为五级，评价的标准为:RGR值ge;100%为0级;75%le;RGR值lt;100%为I级;50%le;RGR值lt;75%为II级;25%le;RGR值lt;50%为III级;1%le;RGR值lt;25%为IV级;0le;RGR值lt;1%为V级，0级与I级即RGF大于75％为无细胞毒性的判定标准[22]。根据这一标准，可以判断GB原液是否有细胞毒性，进而对产品的安全性进行评价,若有毒性，则对可能的细胞毒性原理进行分析。
实验步骤：
- 细胞培养
实验所用的细胞株用RPMI-1640培养基培养细胞并将细胞放在37°C和5%CO2的细胞培养箱中培养。待细胞长满，根据不同的细胞类型进行不同时间间隔、不同浓度比例的细胞传代培养，待传代2-3次后生长状况良好时即可进行后续实验。
- MTT检测
(1)配置不同浓度梯度的GB溶液，溶解所需MTT溶液等。
(2)用胰酶消化对数期细胞，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5times;104个/ml（根据细胞生长快慢，来增减细胞数量）;将细胞悬液轻轻混匀，加入96孔板每孔加入100micro;l，密度为5000个/孔，四周孔用无菌水填充。
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