GnRH与VEGF融合蛋白的表达提取及分离纯化文献综述

 2022-12-06 16:23:52
  1. 课题背景：
  2. VEGF与肿瘤的关系：

VEGF是一种功能强大且能产生多种生物学效应的细胞因子,它是1989年 Gospodarowicz首先从牛垂体滤泡星状细胞培养液中分离纯化得到的一类糖蛋白, 其相对分子质量为34～50KD[1]。VEGF以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞上的VEGF受体，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，提高血管通透性，使肿瘤持续生长，并引起周围纤维蛋白集聚，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管。

肿瘤的生长存在着两个阶段，即无血管的缓慢生长阶段和有血管的快速增殖阶段[2]。前一阶段肿瘤细胞主要通过营养物质的弥散来获得供给，这时肿瘤直径不会超过2-3mm。而恶性肿瘤的生长和转移必须依赖丰富的营养供给, 组织中血管的生成为营养物质和氧气进入肿瘤组织、把代谢产物运出组织细胞外和为肿瘤细胞迁移至靶器官奠定了重要的基础条件。因此血管生成是肿瘤生长和转移的必备条件, 与肿瘤的发生、发展和转移有着密切关系。肿瘤通过调节促血管生长因子浓度上升和抑制因子浓度下降的方式，导致血管形成[3]。在众多肿瘤诱导的血管生成因子中，VEGF是最主要的、特异性最强的一种促血管生成因子。

VEGF可在健康人体的多数组织中表达量甚微，但在结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞中超量表达，与肿瘤发展和预后密切相关[4]。VEGFR的过高表达在多种肿瘤组织的血管内皮细胞及淋巴管上被检测出来，与促进肿瘤转移有关。VEGFR被发现在胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌等肿瘤细胞上也有表达，通过自分泌的VEGF促进肿瘤细胞的增殖和抗凋亡活性，因此抑制VEGF可能直接抑制肿瘤细胞的增[5]。

  1. GnRH与肿瘤的关系：

促性腺激素释放激素(GnRH)是由下丘脑神经元分泌的一种含十个氨基酸的肽类激素, 它于1971年由美国人Schally和Guillemin首先从猪的下丘脑分离并提纯。GnRH 最重要的生理功能是作为生理系统的一种关键性神经调节物质 ,它以脉冲方式分泌,经下丘脑-垂体-门脉循环进入垂体前叶 ,在垂体前叶内作用于促性腺激素分泌细胞, 刺激黄体生成素(LH)及卵泡生成素(FSH)的分泌,从而调节性腺内配子形成和激素功能。

人GnRH-R主要分布于大脑、性腺和胎盘组织，其它的正常组织分布很少。近年来发现，除了存在于垂体发挥促性腺激素合成和释放作用外，许多脑外器官组织中有GnRH存在，在脑、卵巢、子宫内膜、乳腺、睾丸、前列腺、肾上腺、肺等肿瘤细胞上均有GnRH-R分布，作为重要介质和其他生物因子一起，构成复杂的信号传导网络， 起自分泌、旁分泌的作用，与其它生长因子一起调节肿瘤细胞生长[6]。

在黑色素瘤、肝癌、肾癌、口腔癌、喉癌、甲状腺癌、胰腺癌组织中也发现了GnRH及GnRH-R表达。在人类恶性黑色素瘤细胞检测到了GnRH激动剂Zoladex(戈舍瑞林)特异性受体。GnRH-R的拮抗剂也表现出明确的肿瘤抑制作用。此外，许多非激素依赖性肿瘤也能够分泌GnRH，激活肿瘤细胞上高亲和力或低亲和力的GnRH-R直接发挥生长的负性调节作用。因此。GnRH-R的亚型、信号转导机理及其在肿瘤治疗中的应用也成为研究的热点。

  1. 实验设计：
    1. 工程菌培养：

挑取含有质粒pETHG6的单菌落，接种于含50mu;g/mL卡那霉素的LB液体培养液中，37℃恒温振荡培养过夜，再按1%的比例转接入新鲜的LB培养基（Kan 50mu;g/mL ），37℃振荡培养，并于转接后0、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12h分别取样1mL，并用2 mL蒸馏水稀释后测定OD600值。当OD600值达到0.6-0.8时，加入诱导剂乳糖至终浓度5mmol/L,并自此以后每隔一小时额外取样1mL，离心处理后进行12% SDS-PAGE分析。

    1. 菌体的裂解

将菌体以10%（w/v）的比例悬浮在菌体裂解缓冲液（10 mmol/L磷酸缓冲液（PB）（pH8.0），1 mmol/L EDTA，0.1mg/mL溶菌酶，2mu;g/mL DNaseⅠ）中， 37℃振摇约45min，使菌体裂解，同时DNaseⅠ降解菌体破裂时释放出的DNA，使菌液不再粘稠。将裂解完全的菌体在4℃环境下10000rpm离心15min，上清和沉淀分别取样，12% SDS-PAGE检测，目标蛋白应出现在裂解上清液中。

    1. 硫酸铵分级沉淀

在充分搅拌的前提下向菌体裂解上清液中缓慢加入研细的固体硫酸铵粉末，直至硫酸铵饱和度为20%， 4℃放置30min后于10000rpm，4℃离心20min，沉淀留样。于上清液中继续加入研细的硫酸铵粉末至饱和度为25%，同样4℃放置30min后于10000rpm离心20min，沉淀留样。同法操作取得硫酸铵饱和度为30%、35%、40%的沉淀样。硫酸铵饱和度达到40%以后离心所得上清也留样， 12%SDS-PAGE检测不同饱和度硫酸铵沉淀时目的蛋白的含量。

    1. Cellulose-DEAE 52柱层析
      1. 透析

将含目的蛋白最多的硫酸铵沉淀物重新用10mmol/L PB（pH7.4）溶解后，置于预先处理过的透析袋（相对截留分子质量14kD）中，以PB（pH7.4）为透析外液4℃进行透析，每8h更换一次透析液，共透析32-48h。

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