磺酸基转移酶MedB在大肠杆菌中的表达与纯化文献综述

 2022-12-19 19:13:20

磺基转移酶MedB在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

  1. 研究背景

聚酮化合物形成许多具有临床价值的化合物。然而，操纵它们的生物合成仍然是非常具有挑战性的。对基因簇进化的理解为生物合成机制的重新编程提供了理论基础。聚酮化合物是具有显着结构多样性的最大的天然产物之一，是医学重要化合物的重要来源。聚酮化合物的生物合成受聚酮化合物合酶（PKS）控制，其通常在微生物中表现出多模块化结构[1]。在酶反应期间，酮合成酶（KS）结构域催化生长中的聚酮化合物链和与酰基 - 蛋白质（ACP）结构域连接的扩展单元之间的脱羧Claisen缩合，而酰基转移酶（AT）结构域选择并加载扩链剂单位到ACP。酮还原酶（KR），脱水酶（DH）和烯酰基还原酶（ER）结构域分别依次将b-酮基还原为b-羟基，a，b-双键和饱和产物。原则上，PKS的模块化体系结构反映了产品的结构。这种模块化提供了产物分子的基因型和化学型之间的联系，使得PKS不仅适用于基因组挖掘[2]，而且适用于生物工程和合理机制的重新编程。[3]

事实上，过去二十年来，PKS的工程设计已经付出了巨大的努力[4]。 此外，生物信息学和生物合成基因的进化分析已经允许识别区分底物特异性[5]和立体化学结果[6]的关键基元。已经提出cis-AT PKSs的进化情况涉及基因复制和重组[7]，并且基因操作技术的最新进展现在为研究人员提供了工具，以追求“进化引导”的多模态巨合成重编程[8]。目前对PKS机器的理解目前缺乏实现多模块PKS的有效和高效重新编程的关键合理原理，并且更清楚地显示了聚酮化合物如何使多样化变得多样化。

应用基因组挖掘来研究氨基多元醇的生物合成基因簇。从Streptomyces blastmyceticus NBRC12747的草图基因组序列中，确定了一个包含9个由27个模块组成的PKS的基因簇。为了鉴定该巨大PKS簇的产物，培养了S. blastmyceticus，其中分离了具有多烯化合物的特征紫外光谱的介素霉素A和介素霉素B。由于PKS基因簇中的27个模块的组织完美匹配介素霉素A和介素霉素B的分子结构，因此将其命名为中间簇。为了进一步将med集群与mediomycin的产生联系起来，我们使用变铅青链霉菌TK23 Delta;redDX作为宿主进行异源表达。 DNA文库是基于噬菌体为基础的整合载体pKU518构建的[9]，将包含整个中心簇的载体转化到异源宿主中。培养提取物的LC-MS分析揭示了对应于克雷霉素的产物峰。 Clethramycin被认为是由脒基水解酶转化的介素霉素A的生物合成中间体[10]。然而，med簇不编码脒基水解酶同系物。mediomycin是通过med簇和簇外的推定脒基水杨酸进行生物合成的。

二、研究意义

后PKS修改是聚酮化合物结构多样化中的关键步骤。介质霉素A带有硫酸根基团。与糖基化的广泛分布形成对比，硫酸化在后PKS修饰中很少被描述。med簇中的磺基转移酶MedB在大肠杆菌中异源表达，并且使用各种底物在体外筛选纯化的重组蛋白质。结果显示MedB不仅将介素霉素B转化为介素霉素A，而且显示出底物耐受性。使用介素霉素A作为磺基供体和新型四环素B作为磺基受体进行官能团交换测定。结果显示成功的将硫酸盐转移以产生硫酸化的新四糖蛋白B.在MedB中观察到的混杂性表明该酶将是一种有用的，组合生物合成中聚酮化合物支架富集的独特生物催化剂。

三、课题研究内容

  1. pET-28a( )-MedB原核表达载体的构建

PCR扩增含NdeI、HindIII酶切位的点MedB 基因序列，将PCR产物连接到pET-28a( )载体，转化到大肠杆菌BLR(DE3)之后进行测序验证，测序结果与MedB基因进行序列比对结果无误后，采用NdeI、HindIII双酶切PCR扩增的MedB序列及pET-28a( )表达载体，将目的片段与表达载体连接后转入大肠杆菌BLR(DE3)，测序分析确定序列没有突变，并且目的基因插入位点前后接头正确。

  1. MedB蛋白的表达

提取pET-28a( )-MedB载体，转化入大肠杆菌BLR(DE3)感受态细胞中表达MedB蛋白。于LB液体培养基中37℃、220rpm培养12h获得种子液，将种子液以1:100（ml）的比例接种于200ml液体LB培养基中，至OD600=0.8，加入异丙基-beta;-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为1mM以诱导基因表达，并将培养物进一步温育16小时。

3、MedB蛋白的纯化

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