CHO细胞用化学成分限定培养基的研究背景及方法
重组蛋白类药物具有极强的靶向性、特异性，因此被广泛的应用于多种疾病的治疗。1其中单克隆抗体类(monoclonal antibody, mAb)药物作为最广泛被应用于临床的治疗性蛋白药物。因中华仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）产生的蛋白质具有与人类蛋白相似的翻译后修饰机制，易适应无血清培养基，且能在化学成分限定培养基中悬浮生长，有利于生物制药工艺的改进放大。2此外研究已证明CHO细胞能作为质粒安全、可靠的宿主。3因此近70%的重组蛋白药物过程通过CHO细胞培养进行工业化生产。4
用于工业生产中的动物细胞培养基应支持细胞在高密度、高活率状态下生长，并能促进其蛋白产物的合成及向细胞外转运。通常来说用于CHO细胞的培养基以葡萄糖作为主要能量物质及碳源，并添加适量谷氨酰胺作为辅助能量来源及核苷酸合成前体，以促进细胞尽快到达对数生长期。5培养基中的脂质有利于提升细胞活率及促进蛋白产物糖基化。微量的维生素可以有效增加CHO细胞蛋白表达量。6同时，氨基酸作为CHO细胞培养基中的关键成分，其组成的微小变化就能引起CHO细胞生长曲线、蛋白表达量及目标产物糖基化修饰的变化。7
目前，由酵母提取物、大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解物作为氨基酸供体配置而成的培养基广泛用于工业生产中。8蛋白水解物主要为蛋白经酶降解或酸、碱水解后生成的包含氨基酸、多肽、维生素、脂类、金属离子的混合物。9其营养丰富且价格低廉，能有效降低生产成本并有助于提升细胞培养密度、活率及蛋白表达量。10同时，蛋白水解物作为血清的替代物，避免了血清蛋白酶对目标产物蛋白的分解，一定程度上简化了下游产物的分离提纯步骤，消除了血清带来的潜在的免疫原性及病毒微生物污染，11减少了制药工业的质量风险并提高了生产效率，12有助于保证产品质量。13
然而，蛋白水解物复杂的成分常常是工业生产时批次间差异的诱因。蛋白水解物由于其成分不明确及不稳定，常常给细胞培养的一致性控制及合成蛋白纯化带来不可预知的问题。因此，使用化学成分限定培养基进行抗体药物工业化生产是目前生物制药的一个发展趋势。化学成分限定培养基是一类化学成分完全明确的动物细胞培养基，此类培养基完全无血清、无蛋白，可以保证培养基批次间的一致性。化学成分限定培养基有利于在实验阶段跟踪细胞培养的代谢情况，也能在大规模生产中提供获得稳定的细胞培养工艺并简化产物蛋白分离纯化步骤。但是化学成分限定培养基通用性较差，14针对不同细胞株必须进行特异型优化才能使细胞达到较好的蛋白表达水平。15
化学成分限定培养基时通常以基础培养基和适当的补充因子两部分组成。基础培养基提供了细胞生张代谢必须的葡萄糖、无机盐、维生素等，而使用氨基酸替代蛋白水解物，根据细胞生张情况及氨基酸消耗曲线加入合适配比的氨基酸是设计化学成分限定培养基的思路之一。此外，采取培养基混合法，将不同的培养基混合也可以简化复杂培养基组分，评估各个组分及其相互作用以优化培养基。16
现有研究指出，高表达抗PD-1抗体的CHO细胞在生长过程中对氨基酸的消耗情况可使用AccQ Fluor标记游离氨基酸后进行定量分析。现有研究表明，蛋氨酸在细胞对数生长期高速消耗，同时亮氨酸与异亮氨酸消耗速率也高于其余必要氨基酸。在非必要氨基酸中，天冬氨酸在对数生长期消耗较快。17 因此，采用补料分批培养的方法加入恰当的氨基酸混合物有利于细胞高密度、高活率生长。5
本课题拟使用现有生产用培养基配方，去除其蛋白水解物成分并添加氨基酸、维生素，作为基础培养基，并根据工作细胞特性配制主要成分为氨基酸的补料培养基，评价其在摇瓶扩增及2L生物反应器小试过程中细胞密度、活率及蛋白表达情况，并根据氨基酸消耗情况确定补料氨基酸成分与配比，探究化学成分限定培养基对于细胞培养工艺稳定性及批次间一致性的影响，并评估其在工艺放大中的表现，探索适合大规模生产的化学成分限定培养基方案。
1 Awwad, S. amp; Angkawinitwong, U. Overview of Antibody Drug Delivery. Pharmaceutics 10, doi:10.3390/pharmaceutics10030083 (2018).
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
