开题报告内容：
一、研究目的与意义
随着单克隆抗体在杂交瘤技术中日益广泛的应用, 需要对获得的单克隆抗体进行系统地分析和鉴定, 以确定其在各种免疫学试验中的价值。除了对单克隆抗体的理化性质、结合抗原的特异性、以及检测抗原时的敏感度进行分析外, 测定单克隆抗体对特定抗原的结合亲和力，对于选择合适的单克隆抗体用于某一特定目的十分重要。抗体亲和力越高，与抗原的结合能力越强。现如今，测量单抗亲和力的常用方法很多。如：平衡透析法、结合抗原沉淀法、荧光增强法、放射免疫法（RIA）、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、定量免疫电泳法等,方法趋近成熟。而测量单抗亲和力的意义有很多，就目前而言，运用以上的方法测定单克隆抗体对特定抗原的亲和力, 可指导在不同免疫学方法中选用合适的单克隆抗体、早期评价单克隆抗体的优劣、验证单克隆抗体的均一性、研究抗体亲和力对检测抗体水平的影响、研究免疫复合物的形成及抗体的生物学功能等[1]。但在实际工作中, 用ELISA等简便方法测定单克隆抗体的亲和力或活度, 虽已足以指导单克隆抗体的制备和应用，但由于其影响因素多，稳定性差，准确性低。所以对于建立一种更为简便、价廉、稳定的测定单克隆抗体亲和力新方法尤为重要。
二、国内外研究现状
在测定单克隆抗体亲和力方面，ELISA的敏感度已经能测出10-9M 数量级的亲和力常数, 已基本满足一般测定单克隆抗体亲和力的需要，而且无需对抗原或抗体进行标记, 故简便易行, 且防止了由于标记造成的结构修饰而引起测定误差。[2]针对本实验所使用的VEGF抗原也有相应的ELISA试剂盒，但较为昂贵，检测结果易产生偏差，可控因素少。幸运地是，近些年出现了一个新的仪器——微量热泳动仪（MST）。由总部设在慕尼黑的德国高科技公司NanoTemper技术有限公司发明的设备。其公司创始人使用MST测量生物溶液中蛋白-蛋白之间的相互作用[3],[4]，引起了很多科研人员的极大兴趣。在之后短短的一年多的时间，相关数据已经发表到Nature，Cell，PNAS等期刊，大大受到用户们的欢迎。现今，国内已慢慢普及MST仪，由于其在样品处理方面方法简单用量少，在测量数据方面快速准确范围广，在实验操作方面简单迅速实时测，在维护费用方面便宜简便占地少等众多优点，在测量分子间相互作用方面已逐渐顶替其他方法。通用MST测量分子间相互作用使用的是由原厂提供的MST试剂盒，虽高效准确，但价格昂贵，而目前并未有一种无需试剂盒的MST方法。
三、研究方法和手段
1.实验思路：由于以上的现状，本实验望通过进行微量热泳动法和酶联免疫吸附法两种单抗亲和力的检测方法的比较，设计摸索微量热泳动法测量单克隆抗体亲和力。
2.实验方法：具体运用非竞争性酶联免疫吸附法（非竞争性ELISA）测定单克隆抗体的亲和力常数得出抗原抗体反应的Kd值。在已知Kd值得基础上，建立微量热泳动法测定亲和力常数的最佳方法。包括蛋白质的荧光素标记方法优化，纯化标记蛋白方法优化等。最后比较两种方法的优缺点，得出结论。
3.具体研究方案：对此，本实验采用MST和ELISA比较的方式，对已知浓度的抗原和抗体进行亲和力的检测。本次实验所选用的抗原为VEGF165,抗体为全人源抗VEGF165单克隆抗体。
3.1 非竞争性 ELISA
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