开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1.拟研究的问题:
熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic acid, 简称UDCA）是熊胆的主要成分，其化学名称为3alpha;，7beta;-二羟基-5beta;-胆烷酸，是鹅去氧胆素（Chenodeoxycholic acid）的7beta;-羟基差向异构体。熊胆的化学成分比较复杂，包括胆汁酸类、胆固醇类、胆色素类、氨基酸类，还有微量元素。胆汁酸类中含有胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、去氧胆酸(DCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)等。熊去氧胆酸是临床治疗胆结石的有效药物，但是由于合成提取的工艺不同、制剂方法不同、纯度和杂质也不同，导致药物疗效也不同，那用何种检测手段就十分的重要。目前前衍生化RP-HPLC法较为常用，本实验主要研究验证柱前衍生化RP-HPLC法准确测定出能否准确分析熊去氧胆酸软胶囊中熊去氧胆酸含量。
2.研究手段:
采用柱前衍生化RP-HPLC法，对熊去氧胆酸软胶囊含量进行测定。
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流动相 |
以0.001mol/L磷酸二氢钾水溶液（称取磷酸二氢钾0.14g，加水1000ml溶解后，用磷酸调节pH至2.0）-乙腈（53:47）为流动相 |
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色谱柱 |
菲罗门Gemini-C18，5mu;m，250mm4.6 mm |
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流速 |
1.0ml/min |
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柱温 |
35℃ |
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检测器 |
UV紫外检测器，检测波长210nm |
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进样量 |
20mu;l |
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运行时间 |
25min |
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供试品溶液配制 |
精密称取本品内容物适量（约相当于熊去氧胆酸100mg），置50ml量瓶中，加丙酮15ml溶解后超声处理5分钟，放冷，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀后静置作为供试品溶液。 |
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对照品溶液配制 |
精密称取熊去氧胆酸对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释成每1ml中约含2mg的溶液作为对照品溶液。 |
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系统适用性 |
取熊去氧胆酸对照品约20mg和鹅去氧胆酸对照品约8mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸的分离度应大于4.0，熊去氧胆酸的理论塔板数应不小于2000。 |
测定熊去氧胆酸软胶囊中熊去氧胆酸含量。
3. 参考文献：
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2.曹淑玲,郭秋云.HPLC法同时测定熊去氧胆酸片中有关物质的研究.江西中医学院报，2012年10月第24卷5期:49-51.
3.孙文霞，黄毅岚，张丹.RP_HPLC法测定熊去氧胆酸中的有关物质.药物分析杂志 Chin J Pharm
Anal，2007,27（04）:590-592.
4.杨学军,仇丽颖,钟米娜,李琴.RP_HPLC柱前衍生化测定熊去氧胆酸的含量.西南民族大学学报自然科学版第33版第4期，Aug.2007:821-823.
5.金玉,郑长青.RP_HPLC法测定熊去氧胆酸胶囊中熊去氧胆酸及有关物质的含量.沈阳药科大学学报，2014年4月第31卷第4期:288-292
6.郭喆，梁军,袁海龙.高效液相色谱法测定熊胆胶囊中牛磺熊去氧胆酸含量.武警医学 Vol.18 No.06 2007-06:433-435.
7.陈华,梁蔚阳.高效液相色谱法测定熊去氧胆酸胶囊中有关物质的含量.药物生物技术 2005,12(4):248-250.
8.张燕,佟爱冬.高效液相色谱法测定熊去氧胆酸片的含量.中国药品标准2012年第13卷第5期:359-362.
9.隋玉荣,丁一.两种熊去氧胆酸软胶囊主药含量测定方法的比较.中国药房 2013年第24卷第24期:2287-2289.
10.朱丽玢,洪筱坤.HPLC法定量分析熊胆中胆酸类化合物.中草药 2004年11月第35卷第11期:1255-1257.
11.郑兴.柱前衍生RP_HPLC法测定熊去氧胆酸的含量.科技信息，科技视野 2007年第32期：388-365.
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[15]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].二部.北京:化学工业出版社,2010:正文1105-1106.
[16]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].二部.北京:化学工业出版社,2010:正文1106.
4.文献综述：
（1）熊去氧胆酸简介
熊去氧胆酸生理作用是增加胆汁酸分泌，通过阻碍胆固醇的生物合成，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂，有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解。自上世纪80年代发现UDCA具有有效溶解胆固醇性结石的作用以来，不断有新的研究显示UDCA在利胆、护肝、免疫调节等方面具有积极的作用，如可促进内源性胆汁酸的分泌，减少重吸收；拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒作用，保护肝细胞膜；具有免疫调节作用、抑制细胞凋亡、炎症抑制作用、清除氧自由基和抗氧化作用、以及抗肿瘤和利胆等。
（2）高效液相色谱法简述
高效液相色谱法是70年代以后发展最快的一门分析技术。现己成为生化、医学、药物临床、化学化工、食品卫生、环保检测、商品检测等领域最常用的分离分析手段,此外,在天然产物分离、生物样品纯化、手性化合物的拆分等方面也发挥了非常重要的作用。高效液相色谱灵敏、准确,在药物分析领域,方法具有极其重要的地位,占有的比例逐年增加,已经成为我国药物分析论文中使用最高的一种分析方法。可以获得较好的准确度、精密度,且重复性较好,用分析,可根据不同的分析任务选择不同分离机制的色谱类型,如正相、反相、分配等,通过调节流动相,可获得不同的选择性。主要缺点是缺乏通用而灵敏的检测器,目前常用的紫外检测器,对无紫外吸收的物质难以确定,低波长易产生干扰,反相的填料只能在一定的范围内使用,使其应用受到限制。此外对强保留物质的分析时间长,费用高。即便如此,作为一种成熟的检测方法,在分析化学中广为利用。近年来,液相色谱较重要的发展方面是检测器的发展,检测器类型紫外检测器、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发散射检测器、二极管阵列检测器等,此外液相色谱质谱联用等手段,使HPLC获得了更好的发展,在一定程度上弥补了的不足,在药物分析中仍将占据主导地位。
（3）化学衍生法简述
化学衍生法在高效液相色谱分析的作用。化学衍生法指借助化学反应将待测组分接上某种特定基团,从而改善其检测灵敏度和分离效果的方法,利用化学衍生反应达到改变化合物特性的目的,使其更适合于特定的分析过程,在仪器分析中被广泛应用,如色谱包括气相、液相、超临界、薄层、电泳和一些联用技术等、质谱、核磁、紫外一可见、荧光和电化学分析等。气相色谱中应用化学衍生反应是为了增加样品的挥发度或提高检测灵敏度,,而高效液相色谱和毛细管电泳的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂通称化学衍生试剂或标记试剂与样品组分进行化学反应,反应的产物有利于色谱检测或分离。
高效液相色谱不受气相色谱的样品条件限制,应用范围大大扩展。但在检测器的匹配上也有一定的局限。迄今还没有一个同的功检测器相比,通用型的检测器。最适合使用的紫外检测器,具有灵敏度较高、线性范围较宽、对温度不敏感等优点。不过,紫外检测器属选择型检测器,要求被测定的样品,具有一定的紫外吸收。很显然,没有紫外吸收或紫外吸收很弱的化合物,无法直接采用紫外检测器分析。
高效液相色谱仪中常用的紫外和荧光检测器,对于大量的脂肪酸类、羧酸类、醇类等样品的检测效果不佳或不能检测而受到限制,若将这些待测样品进行衍生化,就可大大提高检测灵敏度和检测范围。
一般化学衍生法主要有以下几个目的提高样品检测的灵敏度改善样品混合物的分离度适合于进一步做结构鉴定,如质谱、红外或核磁共振等。进行化学衍生反应应该满足如下要求对反应条件要求不苛刻,且能迅速、定量地进行对样品中的某个组分只生成一种衍生物,反应副产物及过量的衍生试剂不干扰被测样品的分离和检测化学衍生试剂方便易得,通用性好。衍生化常用的反应有醋化、酯化、烷基化、硅烷化、硼烷化、环化和离子化等。从实际分离和检测经验方面考虑,用于紫外衍生化反应的衍生化试剂应具备下列条件在温和的条件下能迅速产生定量的衍生物。为能使用有机溶剂萃取并进行分离预浓缩,形成的衍生物应具有较低的极性。衍生试剂对某一功能团的衍生反应具有高选择性。过量衍生试剂易从反应产物中分离,衍生物具有好的色谱分离稳定性。试剂应具有较大的摩尔吸光度。形成的衍生物应足以抵挡溶剂的背景吸收,应足以抵挡水分子对它们的裂解。试剂合成方法简单,原料易得、毒性小。形成的衍生物在甲醇或乙腊溶液中有足够的溶解度。衍生物对光有足够稳定性。目前,完全具有以上特征的衍生化试剂几乎没有,这促使着人们不断探索以发现更佳的衍生化试剂。
（4）高效液相色谱衍生化处理的分类
①柱前衍生化
根据衍生化样品预处理可分为柱前和柱后衍生化检测。柱前衍生化具有对反应条件要求不高,对流动相及反应速度无限制且反应剩余试剂可以除去等优点,应用较广。
②柱后衍生化
柱后衍生化是在色谱柱和检测器之间所接的反应器中进行的,最简单的反应器是用玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢等材料制成的管状反应器,适应于滞流时间低于30s的快速反应,另一种是柱床反应器,它是由多孔玻珠填充的玻璃或毛细管柱,适用于滞流时间为的中等速度的反应,在玻珠上沉积一层物质,当流动相经过时,其间的溶质就与衍生化试剂反应,如涂一层酶制成固相酶反应器。当羟基甾体类化合物经过反应柱,流出物中的NADH可用荧光法进行检测。
柱前衍生化与柱后衍生化的比较,一般讲,柱前衍生化较易进行,样品的反应与纯化都可以手工或以离线的方式实现,对反应时间和条件也没有很严格的限制,可以使用任何溶剂或混合溶剂,可以使用过量的衍生化试剂,在进样前剩余的溶剂和试剂容易除去,而且可供柱前衍生化的试剂品种比柱后的多。但是对于有些化合物衍生化后有时会得到不止一种产物,因此每一个衍生反应的样品组分会有两个或更多的谱带,从而使色谱峰复杂化。柱前和柱后衍生化方法各有一定的优点、缺点，根据不同需要适当利用。
（5）胆酸类物质的衍生方法
由于胆酸类物质自身没有荧光和紫外的发色基团,许多学者探讨经过衍生化才能在较高波长下检测出来。作为液相色谱柱前衍生试剂,要具有衍生操作简单、衍生物稳定性好、可定量完成反应、有较强的荧光和紫外吸收、灵敏度高、反应范围宽、基体干扰不明显等优点。
衍生方法有很多，如①用2-乙酞溴-6-甲氧基萘对胆酸类化合物反应,作为HPLC柱前衍生化试剂,后来经过改进,加入反应时间由30分钟降到10分钟,条件也温和了。②用乙酞溴芘作为衍生化试剂,生成带有芳环的酯,荧光检测波长增长了170nm。③用腈蒽反应生成蒽胆酸,再进行荧光检测。④用2,4-二硝基苯肼,与CDCA的羟基都发生反应,然后用C18反相色谱柱可以把7alpha;位反应的产物分离出来。
酶催化法：胆酸为生物样品,因而适于用酶一轻基进行反应,产生荧光,进行荧光检测。很多都用3alpha;-脱氢酶固定的对3alpha;-羟基进行反应,产生荧光,进行荧光检测。但在进行脱氢之前需要加入辅酶NAD。也有用NADP与7alpha;羟基反应的,对于3alpha;7alpha;羟基的专一性测定就可以进行了。酶的制备、保存要求都很苛刻,实验室应用还是有困难的。另外还有用环糊精类化合物做荧光试剂、纤维素和多糖衍生物固定相等分析测定胆酸类物质的方法,尚未推广。
综上所述，熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic acid, 简称UDCA），是一亲水性二羟基胆酸，其化学名称为3alpha;，7beta;-二羟基-5beta;-胆烷酸。因为结构上没有紫外吸收基团，为使其能够在紫外检测器中检测必须经过衍生化，因此本文采用合适的衍生化试剂和催化剂，考察了衍生化试剂用量、催化剂用量、反应时间、反应温度四个因素对衍生化结果的影响，最终建立了反相高效液相色谱柱前衍生化测定熊去氧胆酸含量的方法。该法简便、准确，重复性好，灵敏度较高，尤其适用于含量较低的制剂的分析检测。
开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1.拟研究的问题:
熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic acid, 简称UDCA）是熊胆的主要成分，其化学名称为3alpha;，7beta;-二羟基-5beta;-胆烷酸，是鹅去氧胆素（Chenodeoxycholic acid）的7beta;-羟基差向异构体。熊胆的化学成分比较复杂，包括胆汁酸类、胆固醇类、胆色素类、氨基酸类，还有微量元素。胆汁酸类中含有胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、去氧胆酸(DCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)等。熊去氧胆酸是临床治疗胆结石的有效药物，但是由于合成提取的工艺不同、制剂方法不同、纯度和杂质也不同，导致药物疗效也不同，那用何种检测手段就十分的重要。目前前衍生化RP-HPLC法较为常用，本实验主要研究验证柱前衍生化RP-HPLC法准确测定出能否准确分析熊去氧胆酸软胶囊中熊去氧胆酸含量。
2.研究手段:
采用柱前衍生化RP-HPLC法，对熊去氧胆酸软胶囊含量进行测定。
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