课题目的及意义：
紫花苜蓿是一种优良的豆科牧草，产量高、品质好、易栽培，被誉为牧草之王，常用于奶牛及其他家畜的养殖，在全世界种植面积高达3000多万hm2，我国是栽培利用苜蓿较多的国家之一。全国共有14个省区种植苜蓿，主产区以华北，西北为主[1]。然而最近几年，苜蓿根腐病病害使得牧草的营养价值下降，产量降低，成为限制其发展的重要因素。真菌、细菌、线虫等都能导致苜蓿发病。到目前为止，控制真菌病害主要有三种方法：a、改进栽培措施；b、化学药剂防治；c、培育抗病新品种。前两种方法耗资高，而且病原菌容易产生抗药性，污染环境，第三种方法最为可行。
真菌细胞壁的主要成分是几丁质，几丁质酶可降解细胞壁中的几丁质，并催化为N-乙酰氨基葡萄糖和几丁寡糖，从而抑制真菌的生长与繁殖，增强植物的抗病性。研究表明，几丁质酶还具有释放信号分子，参与共生固氮调控，参与发育调控等生物学功能[2]。植物体内几丁质酶的诱导、产生与积累，对于增强植物防卫能力发挥着重要作用[3,4]。同时烟草由于其组织培养的易操作性和较强的再生能力，己成为植物基因工程的模式植物。
对此科研工作者已展开大量的研究，并取得一定的成果。Broglie等[5]将菜豆几丁质酶基因转入烟草，组成型表达的几丁质酶基因对菌核病具有抗性。Jaeh，Howie分别将粘质沙雷氏菌几丁质酶基因导入烟草[6,7]，转基因烟草对立枯丝核苗抗性显著。任春梅等[8]为了提高烤烟品种K326对真菌病害的抗性，以烟草再生植株的叶片为受体，采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因导入烟草，获得了抗卡那霉素的转化植株。陆瑞菊等[9]通过根癌农杆菌介导将水稻几丁质酶基因导入番茄中,得到转基因植株。马龙彪等[10]将几丁质酶基因导入甜菜来提高甜菜对真菌病害的抵抗力。刘伟华等[11]利用农杆菌二元载体转化法和花粉菅通道法，以菜豆几丁质酶基因转化小麦东农7742，获得转基因植株。
根癌农杆菌中含有 Ti 质粒，Ti 质粒有2 个功能区域，分别是 T-DNA 区和 Vir区。农杆菌侵染烟草的机制是：烟草首先吸附携带目的基因的农杆菌至其表面伤口，受伤植物分泌出的酚类小分子化合物可以诱导 Vir 基因表达，然后是 Vir 产物诱导介质粒上的外源基因组的表达。通过对影响根癌农杆菌转化效率的多种因素进行比较，结果表明，植物的材料选择和培养，农杆菌的培养和稀释，植物材料与农杆菌共培养的程度及转基因植株的筛选条件是影响农杆菌转化效率的主要因素[12]。预培养阶段主要是完成细胞的分裂，因为处于分裂状态的细胞有利于外源DNA的整合[13]；共培养阶段，共培养的时间是影响转化率的一个关键因素，时间过长，农杆菌过度繁殖，引起污染，会导致植物细胞的死亡。
本实验的目的在于利用紫花苜蓿克隆几丁质酶基因，借助于新构建的该基因超表达载体，用农杆菌介导方法对烟草进行转化，获得转基因植株，从而提高植物体对病害的抗性，以达到防治植物病害的目的，同时也为进一步将该几丁质酶基因导入紫花苜蓿奠定理论基础,为植物的抗病分子育种提供基础材料和理论依据。
课题实验流程:
1．紫花苜蓿几丁质酶基因的克隆。
本实验根据TRIzol方法从紫花苜蓿中提取出总RNA，再反转录成cDNA,根据序列同源性的方法设计并合成扩增出引物，再通过PCR的方法进行分离克隆。
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