芒属植物基于QRT-PCR表达分析中内参基因的筛选文献综述

 2023-09-14 17:21:17

文献综述

芒属是禾本科（Gramineae.Poaceae）黍亚科（Subfam.Panicoideae）、高粱族（Trib. Andropogoneae）、甘蔗亚族（Saccharinae）多年生的 C4 植物[1]。原产于东亚，广泛分布于东南亚到太平洋岛屿的热带、亚热带和温带地区，全属约 20 种，我国有 8 种和 1 变种，产于南北各地，除新疆、西藏和青海三省外均有分布[2]。芒属植物高可达 2 - 4 m，分蘖多，根系较发达，入土深度一般在 1m 以上，根茎长而发达，且横走于地表下 10cm 左右，可构成一个地下的根系-根茎立体网络系统，地上部分也可形成草丛。叶大部分基生，扁平宽大，而且比较长。顶生圆锥花序，秋季形成红色或灰色花序[3]。芒属植物是 C4 植物，具有高光效、抗性强、纤维素含量高、水肥利用率高、生物产量高、燃烧充分，具有较强的侵袭、生长、繁殖、竞争及生态适应能力以及对粮食作物影响小等点，常常成为山地、丘陵、滩涂、林缘等地的草本优势群落，能够截流雨水、涵养水源、防止表土流失和滑坡，还可提高生物的多样性[4]，而且，被认为是目前最具开发潜力的高产纤维类能源植物之一[5,6]。

实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction即q RT-PCR）技术凭借其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点已经成为分子生物学领域一项重要的研究工具[7,8,9]。自此技术发明以来，该技术在分析基因的多态性以及基因点突变方面取得了重大的突破，被越来越多的应用到微生物学、人类基因组学、传染病诊断学等各领域[10]。以目标基因的c DNA为模板进行反应时，q RT-PCR不仅可以用于监控m RNA表达的变化，定量分析基因在不同生长阶段，不同组织中的转录水平，而且还可用于对不同处理条件下靶基因的空间分析[11,12]。在 q RT-PCR 中，常常使用 2 种荧光物质：荧光探针和荧光染料，其中 DNA 结合染料SYBR Green 1 被研究者广泛使用。在进行 PCR 反应时，加荧光染料于反应体系中，其会在亲本 DNA 完全解链后与 DNA 单链非特异性的结合在一起。退火复性后，荧光染料会渗入到双链 DNA 中，继而发出特定的荧光信号，待反应结束后，SYBR Green 1 分子会分别结合在每一个子代 DNA 双链上。但是也会有没有与双链 DNA 相结合的染料分子，这些染料分子发出的荧光信号特别微弱，完全可以忽略不计，所以 PCR 的增加完全一致于荧光信号的增加。由于 SYBR 只与双链 DNA 结合，所以可以很简单的通过溶解曲线来确定 PCR 反应是否具有特异性。PCR 反应中荧光信号的积累能够实时反映 PCR 的进程，所以通过对其进行实时监测获得达到荧光阈值时的循环数（Ct），然后根据循环数(Cq)计算目的基因的起始拷贝数。由于 SYBR Green I 无特异性结合于 DNA 链，所以在试验前我们必须进行目的基因的特异性检测，以得到更好的试验结果。Taq Man 荧光探针：在进行 PCR 扩增时，在添加一对引物的时候同一时间添加一个具有特异性的寡核苷酸荧光探针。在此探针的一端标记一个淬灭荧光基团，另一端则标记一个报告荧光基团。如果探针完整，淬灭基团就会把报告基团所发射的荧光信号吸收，然而在实际PCR 扩增的时候，Taq 酶的 5-3外切酶活性会对探针进行酶切，继而使其产生降解，所以会导致报告荧光基因分离与淬灭荧光基团，这样荧光信号就会被荧光检测系统接收。即每扩增一条 DNA 链会伴随着一个荧光分子的形成，从而达到了荧光信号的积累和 PCR 产物的形成完全一致的目的[13,14]。

在相对定量PCR 实验中，为了准确获得目的基因的相对表达量，通常需要引入合适的内参基因，校正和消除不同组织初始模板量、RNA 提取、酶促反应等背景误差。理想的内参基因应该在不同组织类型、不同生长阶段及不同环境条件下保持表达水平恒定。以下条件：①中度或高度表达，太高或太低的表达基因也不适合；②不存在假基因，避免基因组 DNA 污染。假基因是指不能指导合成蛋白质的基因；③不受任何外源或内源性因素的影响；④表达水平与目标基因接近；⑤在任何发育阶段及任何组织中稳定表达[15]。

因此，实际研究中常选择能稳定表达的管家基因作为内参基因。管家基因是所有细胞中组成性表达的一类基因，它的产物是维持细胞生命活动所必需的。然而选取一种管家基因作为通用的内参基因，可能造成定量不准确甚至出现错误的实验结果。为了在 q RT-PCR 分析中获得合理可靠的实验结果，通常需要根据实验条件选择1个或者若干合适的参照基因来修正各种误差，以获取更为准确的基因表达量[16]。

目前， 18s 核糖体 RNA（18s r RNA）、肌动蛋白基因（actin）、alpha;微管蛋白基因和beta;微管蛋白基因（TUA，TUB）、多聚泛素酶基因（UBQ）等几个最常见的管家基因通常作为单一的内参基因，适用于大部分的实时荧定量PCR实验中，起到对目的基因的表达量进行校正和标准化的作用。这些常用的管家基因都在一定程度上存在缺陷，它们在不同类型的细胞和组织中、不同器官的发育阶段中以及不同实验条件处理下，它们自身的表达量并不是恒定不变的，这使得管家基因在实时荧光定量PCR中能作为稳定的内参基因这个说法受到了前所未有的冲击[17]。

如下是一些相关方面研究，对于玉米新型内参基因的研究，王兆明等通过分析确定了 20 个玉米特异无内含子基因作为玉米内参基因的候选基因；最终选用玉米 GRMZM2G054655 作为最优玉米转基因检测内参基因，结果表明该基因能在不同转基因玉米品种中稳定表达。Jian 等探讨了 10 个大豆内参基因在 21 个不同组织器官、不同发育时期中的稳定性表达，结果表明 10 个内参基因的稳定性存在显著差异。并且在植物不同发育时期、不同组织器官中，基因的稳定性亦不同，ELFIb 和 CYP2 在不同的组织器官供试样品中的稳定性最好，G6PD 和 UBQ10 的稳定性最差。而 actin2、actin7 和 TUA 在不同发育时期的供试样品中稳定性最好。

为了选出在牡丹中适宜的内参基因，王彦杰设置了三个不同处理：不同组织(根、茎、叶及花瓣)、切花不同开放时期、不同处理(乙烯或葡萄糖处理)的花瓣，分别研究了 5 个常用内参基因在其中的表达稳定性。研究结果显示，试验中选取的基因扩增效率都非常高，而且能够特异性扩增，但是 ubiquitin 在牡丹不同组织或切花不同开放时期的花瓣中表达最稳定；GAPDH 在不同处理的花瓣中表达最稳定。此研究结果对牡丹中关键基因的定量表达分析起到了难以估计的作用。还有Wei， L等分析了ACT、UBQ6、TUB、18S r RNA、EF1-alpha;、CYP、Histone、DNAJ、APT和GAPDH等9个基因在芝麻中的表达稳定性，结果显示，在芝麻不同发育时期，UBQ6和APT最适合作为内参基因，在芝麻不同营养器官中，TUB表达性最稳定，在芝麻侵染病原菌的组别中，DNAJ表现出了最稳定的表达性，Histone基因在不同胁迫条件下表达最稳定，花蕾期则是UBQ6最稳定，在种子发芽期，ACT基因的稳定性最好[18]。还有张慧琴等以华特猕猴桃为实验材料，分析了ACTB、TUB、18S r RNA和GAPDH 4个常见内参基因的表达稳定性，结果表明，在不同组织中TUB和ACTB表达最稳定，18S r RNA在果实的不同发育时期最稳定[19]。

由此可见，内参基因的表达稳定性在不同品种、不同逆境胁迫亦或是不同组织器官中的表达稳定性不尽相同。所以，根据自己的样品种类和试验条件选择适合的内参基因显得尤为重要。我们在实验中需要选取一定数量的内参基因进行实验，然后通过综合分析得到表达最稳定的内参基因和最不稳定的内参基因，对芒属植物在各个生长发育时期的基因研究提供了较为合适的内参基因，具有较好的参考意义。

参考文献：

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