小鼠丙酮酸激酶缺乏症的基因型及表型的研究文献综述

 2023-10-07 08:37:33

文献综述

1、课题研究的现状及发展趋势

1.1 丙酮酸激酶概述

丙酮酸激酶(PK)缺乏是一种罕见的遗传性疾病，可引起慢性溶血性贫血。丙酮酸激酶(PK)缺乏症是一种糖酵解酶病，首次被描述为50年前[1-4]，其特征是终身慢性溶血性贫血，伴有严重的病发症。治疗包括脾切除术和输血[5,6]。因此，对于解决PK缺乏症的潜在基础的新疗法的医学需求尚未得到满足。哺乳动物有2种PK基因编码PKM和PKLR[7]。PKLR控制来自组织特异性启动子的红细胞(PK-R)或肝脏(PKL)亚型的表达。PKLR基因突变的功能缺失导致PK缺失，临床症状明显局限于红细胞(RBCS)，尽管绝大多数与PK缺失相关的突变同时影响PK- R和PKL。PK-R催化糖酵解的最后和不可逆步骤，将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸，并伴随能量载体分子三磷酸腺苷。糖酵解在红细胞中的重要性在于几乎每一种糖酵解酶的突变都会导致溶血性贫血。这是因为成熟的红细胞缺乏线粒体，几乎完全依赖糖酵解来产生ATP。

PK-R是一种四聚体酶，存在于活性较低的t态和活性较高的r态之间的平衡中，这种平衡可以通过与糖酵解的中间果糖二磷酸(FBP)结合而诱导。在数以百计的突变中，其大多数是单核苷酸错义突变，这可能对PK-R催化活性、蛋白稳定性或蛋白表达产生有害的影响。例如，R486W突变，在南欧PK缺乏症患者中占25%，认为它会影响酶的催化效率，而在北欧PK缺乏症患者中发现的R510Q突变会显著破坏活性四聚体物种的稳定性。PK缺乏症是一种常染色体隐性遗传病，患者要么是纯合子，要么是2个更常见的PK-R等位基因突变的的复合杂合子。

1.2基因编辑技术

基因编辑技术越来越多的被应用于小鼠疾病模型构建中，人工核酶介导的锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effectors nuclease，TALEN）技术、成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9）技术[8]、CRISPR/Cpf1技术、Ago/gDNA技术以及结构引导的核酸酶（structure-guidednuclease，SGN）技术等均得到了广泛应用。CRISPR/Cas9基因编辑技术更可谓是掀起了一场全新的技术革命，应用于快速、高效的进行疾病模型的构建。

1.3贫血对脾脏的影响

脾脏有滤血的功能。边缘区和脾索是滤血的主要场所。脾内的大量巨噬细胞可以清除衰老的血细胞（比如红细胞）、抗原和异物[9]。此外，侵入人体血内的抗原，可在脾内激发免疫反应。此外，脾还能够储藏血液。脾脏是红细胞破坏的主要部位，在临床上脾脏的一些病理变化是某些贫血发生的原因。在实验初期查文献得知：溶血性贫血会引起脾脏变大，所以在脾脏重量方面野生型和纯合子肯定会有较为差异的变化。

1.4流式细胞仪的原理与网织红细胞的介绍

是通过流式细胞术对网织红细胞进行检测，流式细胞仪用于检测单细胞或微粒的信号，一般是将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流束（即鞘流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。激发光源经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生激发荧光，同时产生散射光，这两种光信号被在90°方向的光电倍增管。荧光检测器和前向角光电二极管散射光检测器接收[10]，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过 A/D 转换器，将转换来的电信号转换为数字信号输送给计算机。计算机将各种数字信号进行计算处理后，得到相应的细胞大小、活性、细胞内细胞因子、DNA 含量和细胞周期、核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）含量、酶和抗原的性质等参数。

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