(一) .荧光探针的机理
在我们日常生活做实验的过程中，常常会用到荧光标记或者其他关于荧光的一些实验方法，而我们现在接触得比较多的是荧光探针的方法，对于荧光来说，其是指某些物质被激发后, 电会子从基态跃迁到激发态。激发态电子又会通过辐射和非辐射跃迁回到基态。辐射跃迁伴随着光子发射, 就产生了所谓的荧光或磷光。电子由第一激发单重态(又称单重激发态或者S1单线态)的最低振动能级回到基态时发出的光就称为荧光；电子由第一激发三重态(又称三重激发态或者T1三线态)的最低振动能级回到基态时发出的光为磷光[1-2]。非辐射跃迁造成的能量损失导致发射光子的能量一般小于吸收光子, 因此荧光物质的发射波长通常大于吸收波长。
目前以荧光为机理的检测手段中, 用于生物体内的实时快速检测的荧光探针研究得最为深入。荧光染料是最早应用的荧光探针, 并且现在也在使用。然而, 荧光染料也有显著缺陷。其一：荧光染料的荧光寿命仅只有几纳秒, 与生物样本的自发荧光衰减时间相同, 背景干扰严重；其二：大部分荧光染料的发射波长均小于800nm, 只可以用紫外-可见光探测。紫外-可见光不仅会对生物体造成放射伤害,还容易导致荧光背景的严重干扰；其三,荧光染料的荧光强度弱, 光漂白和光解现象严重, 光解产物对细胞有害；其四, 激发光谱较窄, 很难同时激发多种染料；最后, 荧光染料的特征谱较宽且分布不对称, 很难区分不同染料的荧光, 不能同时检测多种组分。因此, 人们让染料与二氧化硅[3-5]、聚合物[6]、纳米颗粒掺杂[7-8],力图改进荧光染料的性能。但是这些改进措施的作用都较有限。因此, 寻找并制备新型荧光探针成为了化学家为之奋斗的目标。
而一般我们选择荧光探针的标准为: 易于合成纯化, 产率高, 安全无毒，稳定性和溶解性好, 透膜脂溶性强；能与被标记物通过物理或化学作用特异性结合, 标记条件温和, 残余物及副产物易于除去；还要有较高的荧光量子产率, 摩尔消光系数大,有较强的抗漂白能力, 荧光与背景对比明显, 激发、发射波长能有效避免细胞自发荧光的背景干扰。目前, 荧光探针能检测的物质不仅包括DNA,RNA和蛋白质等生物大分子, 还包括多肽、葡萄糖、麦芽糖等有机小分子。除此之外, 自由基等活性氮氧物种、NO、CO、H2S等气体信号分子、质子、金属离子、阴离子等无机分子也可以用荧光探针进行实时监测。
根据最近几年己知的相关数据进行整理可知：分子类的荧光探针得到了非常快速的发展。荧光探针是指在一定波长的光的激发条件下，用荧光物质作为其指示剂并使其发出荧光，通过检测分析其产生的荧光来实现检测物质的定性和定量分析。分子类荧光探针具有以下几类优点：(1)具有很高的灵敏度。(2)动态响应的预留时间很长。(3)具有良好的选择性。(4)无需进行预处理。(5)使用简单操作方便。(6)不会受到外界的电磁场的影响和远距离发光。(7)在化学、物理学、生物化学、医药学等领域中的应用十分广泛。
我们在实验过程中最常用的也就是阳离子荧光探针，而阳离子荧光探针是由荧光基团，连接体基团和识别基团三者共同构架成的一个完整的荧光探针。荧光基团和识别基团是由连接体基团连接的，它们构成一个荧光探针的分子，连接不同的基团就有不同的作用，就可以对不同的物质进行识别，出现荧光或者荧光猝灭的现象之后，就可以根据此现象鉴别各类物质种类。荧光基团在获得光能后激发后能够发射稳定的荧光，而荧光分度计可以对这种荧光进行观测并加以量化，一般具有大环的共轭体系分子就具有良好的荧光量子产率，十分适合用作荧光基团，也是制作荧光基团的首选体系之一。其荧光分子探针中含有一个对金属阳离子识别的基团，并且该基团中含有对金属阳离子和荧光团有着电子供体作用的原子，该原子即是推拉电子体系中的电子给体，又是探针分子中的识别基团。当金属离子与此类探针结合以后，由于金属离子具有拉电子效应，会降低识别基团的供电子能力，会使吸收光谱发生蓝移，这是由于光诱导效应导致电荷转移从而减少识别基团上的电子云密度，导致金属离子与识别基团之间的作用被削弱或消失，使荧光光谱发生蓝移。此类荧光探针发出荧光的机理是受到外界的光源(紫外线或X射线)的照射下提供激发能使其激发到激发态的能量，从而荧光基团通过发射荧光来达到稳定状态[9]。
（二）荧光探针的分类
目前常用的荧光探针有荧光素类探针、无机离子荧光探针、荧光量子点、分子信标等降低，这就是荧光探针技术。荧光探针可有多种分类方法：按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外区的荧光探针；按荧光探针目标生物分子的种类可分为蛋白质荧光探针、核酸荧光探针、多糖荧光探针；按荧光探针与物质的结合方式可分为共价键结合式和非共价键嵌入式，共价键结合的标记物比由非共价嵌入式所得复合物更稳定；按荧光探针用途不同可分为荧光标记试剂和荧光生成试剂；按荧光探针物质本身的性质又可分为有机(包括稀土金属有机配合物)荧光探针、量子点荧光探针、高分子荧光探针等。荧光探针的构型主要由荧光报告部分、连接部分和识别部分组成。(1)荧光报告部分指的是探针中的荧光团，它的主要作用是通过化学信号的方式将环境变化的情况传输出来，起到了信号表达的作用。(2)连接部分就是将荧光报告部分和识别部分连接起来的重要部件，它影响着信号输出的情况。(3)识别部分是荧光分子探针中最为重要的结构单元，它能够特异性地结合客体或与之发生反应，引起探针分子的信号改变，从而起到专一识别被检测物的作用[10]。荧光探针分子中，荧光报告部分、连接部分和识别部分三者缺一不可，但其中起主导作用的是荧光报告部分和识别部分，他们分别影响探针分子的敏锐度和特异选择性能。而常见的的荧光团有香豆素，芘类，氧杂蒽类，菁染料，萘酰亚胺类，氟硼二吡咯类，喹啉类等等。随着生物技术的不断发展，荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、细胞检测及医药研究等方面发挥了重要作用。 （三）罗丹明在荧光探针中的应用
目前，应用到探针分子中的常见荧光基团主要有罗丹明类、荧光素类、香豆素类、氟硼二吡咯类等。其中香豆素的优点有光稳定性较好、stokes位移较大、分子体积较小、细胞穿透能力强等。但是其缺点是吸收/发射波长较短。香豆素的应用主要是用于药物研发、微生物标记、纺织和激光染料、荧光标记[11]。
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