毕业论文课题相关文献综述
1.简介
1.1细胞增殖和毒性试验
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。增殖检测一般是分析分裂中的细胞数量的变化，进而反应细胞的生长状态及活性。细胞毒性是指某种化学物质或病毒等作用于细胞基本结构或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构、细胞的新陈代谢过程等，导致细胞存活、增殖的紊乱，所引发的不良反应。
细胞毒性试验和细胞增殖检测是紧密相连的，某种物质的毒性越大，便会越影响细胞进行正常增殖。细胞增殖和毒性试验目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域，不仅在研究细胞的基本生物学特征中非常重要，而且是分析细胞状态、研究遗传性状的一种基本方法，可为探讨疾病的发病机制、诊断疾病及治疗疾病提供有价值的资料。
1.2 细胞增殖检测方法
检测细胞增殖的方法目前主要可以分为DNA合成检测、细胞增殖相关抗原检测和代谢合成检测等。直接测定DNA合成含量，是检测细胞增殖最准确的方法。这一类方法包括胸腺嘧啶核苷（3 H-TdR）掺入法、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）法、5 -乙炔基-2' 脱氧尿嘧啶（EdU）法等。
细胞增殖相关抗原检测和代谢合成检测则都是间接的方法。细胞增殖相关抗原主要有增殖细胞核抗原（PCNA）和Ki67抗原等。PCNA 分为可溶性和不可溶性两种，后者在细胞合成周期中的含量变化与 DNA 合成一致，因此 PCNA 可用于检测处于增殖状态的细胞。Ki67抗原可用于用来识别生长中的正常细胞和肿瘤细胞，在多种肿瘤中均有显著改变，是确定良、恶性组织生长状态的一种标记。
代谢活性检测方法主要有MTT 法( 噻唑蓝比色法)、MTT 法( 二甲氧唑磺比色法)、MTS 法( 内盐法)、WST-1法(四唑单钠盐法)、Cell Counting Kit-8（CCK-8）等。这一类实验方法的原理基本类似，活细胞内的某些脱氢酶可将一些四唑盐还原为有色产物，产物数量即颜色深浅可粗略反应活细胞数量。早期使用的一些四唑盐存在一定的缺陷，特别是还原产物不溶水，且对细胞有较大毒性，限制了其使用。
1.3 Cell Counting Kit-8（CCK-8）
CCK-8是日本同仁化学研究所（DOJINDO）开发的用于检测细胞增殖、细胞毒性实验的试剂盒，以2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐（WST-8）和1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐（1-甲氧基PMS）作为主要成分，属于代谢活性检测方法。WST-8是一种高度水溶性四唑盐，现已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等领域[1-5]。
WST-8在电子耦合试剂（1-甲氧基PMS）存在的情况下，可以被生物细胞线粒体内的一些脱氢酶还原生成深色高度水溶性的甲臜产物。相关研究[2,6]发现，在细胞增殖实验中，细胞增殖越多越快，则生成的甲臜量越多，溶液颜色越深，特定波长处的吸光度和细胞数量可呈良好的线性关系，从而可以用于定量反映细胞数量的变化。
WST-8作为细胞活性检测试剂，与其他同类产品（如MTT、WST-1等）相比有明显的优点[7,8]。WST-8生成甲臜产物是高度水溶性的，不需要有特定的溶剂来溶解，从而省去后续的溶解步骤。WST-8 对细胞几乎没有毒性，也更加稳定，线性范围更宽，灵敏度更高。
2.研究进展
2.1 WST-8的合成
Ishiyama等[9]先后合成了2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐（WST-1）和2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-苯基-3H-四唑-2',4'-二磺酸钠盐（WST-3）两种水溶性四唑盐试剂，但是均存在灵敏度或稳定性不高的问题。WST-8是在WST-3上基础上将同一个苯环上的两个硝基分散到两个苯环上，将其上一个碘基替换成甲氧基。这样的设计使得WST-8兼具WST-1的高稳定性和WST-3的高灵敏性，同时又有更高的水溶性。合成方法上，以苯甲醛-2， 4-二磺酸钠和对硝基苯肼作原料，生成中间产物腙。腙再与2-甲氧基-4-硝基重氮盐偶合，得到甲臜。然后在酸性条件下，经亚硝酸异戊酯氧化关环，得到WST-8。总收率为20.4%。
该合成方法存在收率低，后处理困难等问题。对该方法的改进主要集中在最后的氧化步骤上。高卫民等[10]改用氯气作为氧化剂，使反应不存在任何副产物，易后处理，3步总收率为 32%。但是氯气毒性较大，不利于工业化生产。刘宏民等[11]采用NBS作为氧化剂，总收率达到34.4%。
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