开题报告内容：（包括拟研究解决的问题，采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题目的：了解注射用重组人尿激酶原对急性心肌梗死的溶栓的作用；了解重组人尿激酶原全长cDNA的构建；了解CHO细胞表达重组人尿激酶原的优势；重点研究CHO细胞表达重组人尿激酶原的发酵培养，在严格无菌的基础上扩增放大生产。
研究内容： CHO细胞表达重组人尿激酶原的适宜条件及细胞密度对发酵培养的影响；发酵培养仪器的常规无菌操作；放大生产的基本步骤。
进度安排：
- 选题意义
动脉发生栓塞是血栓类疾病(如心肌梗塞)的一个重要原因。溶栓治疗被认为是治疗血栓最为有效的方法，临床上所用的溶栓药物大多为纤维蛋白溶解酶原(简称纤溶酶原)激活剂类药物，它们可以将纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶可以溶解栓塞位置的纤维蛋白，从而恢复血液的畅通。目前常用的溶栓药物有链激酶、组织型纤溶酶原激活剂}t-PAS、尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)、重组组织型纤溶酶原激活剂((rt-PA),对一甲氧苯甲酞纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC)和重组链激酶(r-SK)等，它们的溶栓疗效肯定，但是还存在一些缺陷(如初始再灌注延迟或失败、出血、再梗塞等)，阻碍了溶栓疗效的进一步提高。因此，随着对溶栓药物结构和功能的研究，寻找和研制溶栓效率高、特异性强、具有纤维蛋白选择性、半衰期长的溶栓治疗药物对于更有效治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。
人尿激酶型纤溶酶原激活剂(human urokinase-type plasminogen activator, hu-PA )作为一类重要的纤溶酶原激活剂，在心血管疾病的治疗中具有广泛的应用前景。hu-PA有两种分子形式，即尿激酶原(单链尿激酶，scuPA或pro-UK)和双链尿激酶lt; tcuPA或UK ) 。pro-UK是一种单链丝氨酸蛋白酶原，由411个氨基酸残基组成，分子质量54kDa。pro-UK作为第二代溶栓药物，可选择性地在纤维蛋白表面活化纤溶酶原，溶解血栓，而对血液中的纤溶酶原、纤维蛋白原和抗纤溶酶原等作用很小，因此在溶栓治疗中出血副的作用很小。但是pro-UK的一个
显著特征是在低剂量时更具有选择性，在低浓度时它对结合在纤维蛋白表面的纤溶酶原具有激活作用而对游离的纤溶酶原的激活作用很弱。在临床治疗血栓时，为了保证溶栓效果而使用较高的剂量，pro-UK就丧失了其低剂量时的特异性。所以人尿激酶原的改造，宿主动物细胞的高效表达，宿主动物细胞的发酵培养对于更有效治疗血栓性疾病具有十分重要的意义，成为当今该治疗药物研究的一个发展方向。
- 论文综述
- 人尿激酶原基因的改造
- 选择突变位点的依据
凝血酶（Thrombin）可催化pro-UK的Arg156-Phe157之间肤键的水解，产生凝血酶断裂型的UK双链，该双链仅具有微弱的激活纤溶酶原的活性，并且可有效抵抗纤维蛋白溶解酶对其的活化。而新形成的血栓中凝血酶浓度较高，使pro-UK活性迅速降低，从而影响了pro-UK治疗的效果。临床报告显示，心肌梗塞病人的血液中PAI-1的浓度远高于正常人。研究发现， pro-UK表面可变环中的许多带正电荷氨基酸残基(R 178RHRGGS 184)可与PAI-1分子中的带负电荷氨基酸残基形成“盐桥”，该盐桥在PA与PAI-1结合过程中起决定性作用。David等将pro-UK Arg179-Ser184段删除，获得突变体在PAI- I存在时仍保存90%左右的活性，但未确定氨基酸的具体位置「114];用苯甲酞甲醛处理尿激酶原，可导致Arg残基改变，研究结果表明改变四个Arg残基可使衍生物在血浆中最稳定，且具有更高的溶栓活性，推测该四个Arg残基中有3个位于尿激酶原表面的可变环中，另外的一个Arg残基可能就是Arg156。构建Pro-UKM3的设想是采用分子生物学手段改造pro-UK，一降低表面可变环的正电荷，防止其与PAI-1形成“盐桥”，从而消弱PAI-1对活性的抑制。
- 基因定点突变的方法
目前所用的定点突变可以采用取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基，由于其简单易行、重复性高等优点，现已成为基因操作的一项基本技术。定点突变方法主要有盒式诱变、寡核昔酸引物诱变及PCR诱变等。所谓盒式诱变(cassette mutagenesis)就是利用一段人工合成的具有突变序列的寡核普酸片断取代野生型基因中的相应序列，该方法具有简单易行、突变效率高等优点，不变之处是在靶DNA区段的两侧需要存在一对限制性单切点，而一般的靶DNA序列难以满足此要求。寡核昔酸引物诱变是应用合成的含有突变位点的寡核普酸短片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核普酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组分，取代了原来的特定核普酸。该方法产生的突变的比例由于甲基介导的碱基错配修复系统的存在而较低。本研究采用PCR介导的定点突变法，可以在DNA片段的任何部位发生突变。它在第一轮PCR中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的中间引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两个在其突变区具有相同的突变。这两条双链经变性、复性处理后，形成异源分子，延伸后即获得突变DNA，以此为模板，用两端的引物PCR即可扩增得到大量含有突变位点的DNA片段。该方法获得目的突变体的效率可达100，但也有不足之处，一是突变体的全序由于采用PCR保真性稍差，需要进行序列测定，确证没发生其他突变;一是需要再连接到载体上，才能进行基因转录、翻译方面的研究。
- 宿主动物细胞的发酵培养（CHO细胞）
在众多哺乳动物细胞系中，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)已成为生产外源重组蛋白类药物的首选宿主细胞。美国FDA批准上市的抗体类药物中采用CHO细胞为表达宿主的有13种，而且正在研究和开发的生物技术药物中有70%以上是以CHO细胞为表达系统。在各种哺乳动物细胞表达系统中，之所以首选CHO作为宿主细胞，就因为与其它哺乳动物细胞相比，CHO细胞具有以下优点:(1)遗传稳定性高;(2)重组基因的高效扩增和表达能力，外源基因的稳定整合;(3)准确的翻译后修饰功能，使得表达的外源蛋白质在分子结构、理化性质以及生物学功能方面最接近于天然蛋白分子;(4)既可以贴壁生长，又可以被诱导成悬浮培养，而且具有较高的耐受剪切力和渗透压能力，为动物细胞大规模培养提供了有利条件;(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，而且培养体积能达到1000 L以上，使动物细胞大规模培养成为现实;(6)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，有利于下游产物的分离纯化。
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