在大肠杆菌分批补料的条件下，利用乙酸香叶酯生物转化为香叶醇，实现高效的香叶醇生产
摘要
背景：香叶醇是一种展示了优良汽油替代性前景的无环单萜。香叶醇是一种植物中天然存在的低浓度物质，并且它也是微生物工程的一个有吸引力的目标。香叶醇已经可以在异源大肠杆菌中生产，但是它的低产量阻碍了它的工业应用。此外，香叶醇通过大肠杆菌的生物转化还存在大量的未知。
结果：重组高表达的罗勒香叶醇合成酶，冷杉属的香叶基二磷酸合酶，并通过异甲戊二羟酸途径在大肠杆菌BL21(DE3)中可达到每摇瓶68.3plusmn;3mg/L的香叶醇产量。初始的分批补料发酵香叶醇只将产量达到78.8mg/L。为了更好的提高产量，我们优化了发酵条件。首先，具有挥发性的香叶醇在发酵的前5个小时里，从无溶剂系统中损失了81.4%。因此，肉豆蔻酸异丙酯被加入到培养基中来形成水-有机相两项培养体系，这样可以有效的避免香叶醇的挥发。第二，大多数香叶醇在大肠杆菌中最终被转化成了乙酸香叶酯，由此减少了香叶醇的产量。我们首次揭示了大肠杆菌中乙酰酯酶(Aes,EC33.1.1.6)水解乙酸香叶酯得到香叶醇的作用，并且在受控的条件下成功将香叶醇产量提高到2g/L。
结论：通过在大肠杆菌菌株中过表达几种关键途径的蛋白并结合受控发酵系统，建立了高效的香叶醇生产平台。使用我们可控的水-有机两相发酵系统，可获得约2.0 g / L香叶醇，这是迄今为止最高的产量。此外，我们首次阐明了香叶醇和乙酸香叶酯在大肠杆菌中的相互转化。这项研究提供了一个新的有希望的香叶醇生物合成方法，为大规模工业应用奠定了基础。
关键词：香叶醇，乙酸香叶酯，分批补料发酵，乙酰酯酶，大肠杆菌
背景
从花中散发出来的单萜香叶醇(3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇的反式异构体)已经被广泛的应用在香水，制药和其他产业。作为一种汽油替代品，香叶醇由于低吸湿性，高能量含量和相对较低的挥发性而优于乙醇。香叶醇来源于香叶基二磷酸(GPP)，可通过甲羟戊酸(MVA)途径或甲基赤藓糖醇磷酸途径合成。但是香叶醇由于只能从天然植物中提取出来很低的浓度，所以具有很低的经济价值。通过微生物宿主的代谢工程可以产生大量的增值产品。与植物不同，微生物通常不会携带特定的GPP合成酶(GPPS)并且除了少数酿酒酵母菌株可以设法产出(达到5mg/单萜)，其他的都不能产生单萜。近些年，香叶醇已经成功的在大肠杆菌和酿酒酵母中异源产出。法呢基二磷酸合酶(FPPS)中的突变使GPP释放以用于含有单萜合酶的重组微生物中的单萜生物合成。一项近期的研究证明，GPP在承载突变的FPPS酵母中的积累能够使香叶醇在缺少异源香叶醇合酶的情况下，通过内源去磷酸化使之有可能形成。尽管GPP的释放机理仍不清楚，香叶醇甚至能够在缺少特定GPP或者突变FPPS的情况下，在大肠杆菌中通过过表达一种罗勒香叶醇合酶(GES)而产出。通过在酿酒酵母中共同过量表达FPPS突变体和GES，培养7天后获得5 mg / L香叶醇。在同时含有基因调整过的MAF1和GES的酿酒酵母中过表达MVA途径中的关键限速酶培养48小时后，香叶醇产量进一步增加到36.04mg/L。到目前为止，通过具有完整MVA途径和GES的香叶醇脱氢酶突变体大肠杆菌在培养48小时后，最大量的香叶醇已经被产出(182.5mg/L)。但是作为工业应用，这个产量仍然很低。
此外，香叶醇通常会在芳香植物中生物转化为其它萜类，从而会影响蒸馏精油的质量。在香柏叶中香叶醇转化为反式柠檬醛是通过NADP 依赖的香叶醇脱氢酶催化实现的。同样，一些酿酒酵母可以修饰游离萜类化合物的内容，尽管它们产生单萜类化合物的能力有限。酿酒酵母能够在OYE2酶的催化下将香叶醇转化为香茅醇，并且在酿酒酵母发酵过程中，ATF1醇乙酰转移酶参与了香叶醇的乙酰化反应。与广泛的酵母研究不同，香叶醇在大肠杆菌中的生物转化很少被提及，直到最近，香叶醇在大肠杆菌中被YjgB酶脱氢和异构成其它香叶素(橙花醇，橙花醛，香叶醛)才被提及。以此为动力，我们创造了一个高效香叶醇生物转化菌株，并且开发了一种新的高性能发酵策略以增加香叶醇的产量。此外，我们观察到了香叶醇和乙酸香叶酯在大肠杆菌中相互转化。乙酸香叶酯被水解成香叶醇的机理因此被研究，并控制用于进一步提高香叶醇产量的生产。
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