代谢工程提高解脂耶氏酵母油脂积累的研究文献综述

 2021-11-04 20:47:14

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文献综述

1.1 产油微生物简介

产油微生物是指自身能够合成的油脂含量超过其细胞干重的 20%的微生物[1]。这些合成的油脂称为微生物油脂，又称单细胞油脂，主要以脂滴的形式存在于产油微生物的细胞器中[2]。产油微生物包括细菌、真菌、酵母和微藻。其中产油酵母是研究最多的，因为它们生长速度快，能快速达到高生物量，这对于快速生产大量的油脂是至关重要的。自然界中存在包括Rhodosporidium, Lipomyces, Candida, Yarrowia属在内的多种产油酵母[3-5]。不同产油酵母体内油脂含量存在较大的差异。例如，环状红孢子菌（Rhodosporidium toruloides）可以自然地积累细胞中70%的油脂含量，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）在自然情况下通常可以积累20-40%的油脂含量[6-8]。合成的微生物油脂包括中性脂质（三酰甘油，硬脂酸酯和游离脂肪酸）和功能性脂质，这些脂质作为细胞的能量储备。中性脂质的组成因微生物而异，通常在产油酵母中，油脂主要以三酰甘油的形式储存在称为脂质体（LB）的特殊细胞器中。

1.2 解脂耶氏酵母简介

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）属于半子囊菌纲、耶氏酵母属，是一种典型的非常规产油酵母。解脂耶氏酵母作为 FDA 认定的安全微生物，已被广泛认为是生产基于脂质的生物燃料和油脂化学品的优越工业宿主[9]。引起这种油性表型的关键代谢特征包括：高乙酰辅酶A通量、高三羧酸（TCA）循环通量和缺乏发酵能力[10]。此外，解脂耶氏酵母具有利用各种蛋白质和疏水性底物的能力，这些底物可以由廉价的可再生碳源提供，并且可以在很广的pH范围和盐度条件下生长[11,12]。相比于其他微生物，解脂耶氏酵母的脂质代谢相关途径已经得到了广泛的研究，它拥有大量的基因工程工具，且基因组已经被完全测序[13-19]。最近，无处不在的基因组编辑技术CRISPR-Cas9在解脂耶氏酵母中也得到了应用，它允许高频同源重组以及有针对性的基因插入和删除[20，21]。凭借这些独特的新陈代谢特性和最近开发的大量基因工程工具，这个工业宿主在未来大量新产品的经济和可再生生产方面显示出巨大的希望。

1.3 解脂耶氏酵母油脂积累途径和机理

在解脂耶氏酵母体内油脂可通过两种不同的途径积累[22]：(1) de novo途径，指以亲水性碳源（如糖、有机酸和醇）为底物，在特定条件下产生脂肪酸前体，如乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，并将其整合到Kennedy途径中合成油脂；(2) ex novo途径，指以疏水性碳源（如脂肪酸、三酰甘油和动物油脂）为底物，这一途径需要疏水底物(HS)的水解，水解的脂肪酸在细胞内运输，以不变或修饰的形式在细胞内积累被重新组装为TAG和甾酯(SE)，并在LB中积累。表1总结了这些途径中涉及的主要酶。

在此，本文只简述解脂耶氏酵母通过de novo 途径合成脂肪酸与甘油酯的代谢过程。当培养基中的氮变得稀缺时，此过程被激活，从而引起一系列级联调节反应。首先，氮限制会导致AMP脱氨酶1（AMPD1）的酶活受到限制，使得酵母细胞内 AMP 含量快速下降，进而引起异柠檬酸脱氢酶（IDH）活力下降，导致三羧酸（TCA）循环的下调，使得柠檬酸在线粒体中积累，最后过量的柠檬酸从线粒体分泌到细胞质中。在下一步中，细胞质中的柠檬酸被ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）裂解为胞质乙酰辅酶A和草酰乙酸。该途径不同于传统酵母所用的丙酮酸-乙醛-乙酸途径，是产油酵母的特征途径。

一旦细胞质中的乙酰辅酶A形成，它就成为脂肪酸延长和最终脂质合成的基本双碳构件。首先，乙酰辅酶A经乙酰辅酶A 羧化酶 (ACC1) 催化生成丙二酰辅酶A，然后，脂肪酸合成酶复合体(FAS1和FAS2)作用于丙二酰辅酶A，催化以下反应生成脂酰辅酶A：acetyl-CoA n malonyl-CoA 2n NADPH → Cn 2-acyl-CoA n CO2 2n NADP n CoASH。其中FAS1和FAS2两个亚基都以NADPH为还原力，脂肪酸酰链每延长一步，都需要两个NADPH分子。脂肪酸酰链不断延长形成碳十六酰基载体蛋白（C16 acyl-ACP），然后这些C16 acyl-ACP被运输到内质网(ER)，进一步延长和去饱和度[23-25]。内质网上有两种去饱和酶，其中Δ9去饱和酶OLE1催化生成棕榈油酸(C16：1)和油酸(C18：1)的生成，FA去饱和酶2(FAD2) 催化亚油酸(18：2)的生成。自然合成脂肪酸的链长通常为16或18个碳。

三酰甘油（TAG）是由三个脂肪酸和一个3-磷酸甘油醛(G3P)通过Kennedy途径缩合而成[15]。最初，G3P被G3P酰基转移酶(SCT1)酰化生成溶血磷脂酸(LPA)。LPA随后被LPA酰基转移酶(SLC1) 进一步酰化生成磷脂酸(PA)。然后，PA被磷脂酸磷酸水解酶(PAP)去磷酸化，释放出二酰基甘油(DAG)。最后，DAG通过依赖于酰基CoA或不依赖酰基CoA的反应合成TAG，其中依赖于酰基CoA的反应由以酰基CoA为最终酰基供体的DAG酰基转移酶(DGA1、DGA2、ARE1、ARE2)催化；不依赖酰基CoA的反应由以甘油磷脂为酰基供体的磷脂DAG酰基转移酶(LRO1)催化。这些反应发生在内质网(ER)和脂质体(LB)表面上，相关酶位于ER和LB表面[26]。由ARE1和ARE2基因编码的两种甾酯（SE）合成酶，已经被证明通过在酰基CoA依赖的机制中作为酰基转移酶来促进DAG酰化[3，27]。Are1p和Are2p是参与甾醇酯化的唯一SE合成酶，因为缺少这两个基因的双突变体不能合成SE[28]。

除了合成途径外，油脂降解途径也与解脂耶氏酵母油脂的过量积累有关，因为它们经常成为被敲除的目标途径。在营养受限的条件下，解脂耶氏酵母体内的甘油三酯会发生降解，生成游离脂肪酸(FFA)。FFA在过氧化物酶体中通过β-氧化反应生成其他物质，用于维持细胞代谢。FFA可以通过细胞内脂肪酶TGL4[3，29]降解甘油三酯生成。FAA必须通过酰基CoA合成酶(FAA1)活化为酰基CoA，才能进行进一步的生物加工[30]。这些长链酰基CoA被β-氧化途径降解(图1)发生在过氧化物酶体中。在β-氧化反应中有四个反应以循环方式发生，其综合效应是释放乙酰辅酶A分子，从而将酰链缩短两个碳单元。在解脂耶氏酵母中，鉴定出6个催化第一反应的酰基辅酶A氧化酶(POX1-6)，每个酶具有不同的链长偏好[3，31，32]。第二个和第三个反应（水合和脱氢）均由多功能酶(MFE1)催化，最后一个反应由3-酮酰辅酶A硫解酶(POT1)[3，33，34]催化。图2总结了脂质合成及降解的途径。

1.4 代谢工程提高解脂耶氏酵母油脂产量的研究进展

微生物油脂化学品的成本效益取决于几个重要的标准，包括油脂含量（lipid content）、油脂效价（lipid titer）、油脂产量（lipid yield）和油脂生产力（lipid productivity）。解脂耶氏酵母合成油脂的能力受到很多因素的影响，包括自身代谢前体物的合成（如 NADPH、ATP 与乙酰辅酶A 等）和外界发酵环境（如培养基、C/N、pH、接种量、发酵模式等）。此外，它还受到次生代谢产物的影响，如柠檬酸盐和乙醇。随着代谢工程与合成生物技术的发展，通过优化解脂耶氏酵母体内复杂的代谢网络，可以进一步提高油脂的合成。当前，采用代谢工程手段提高解脂耶氏酵母合成油脂能力的策略主要包括：（1）敲除或抑制油脂降解相关基因，阻止油脂的降解途径，如β-氧化;（2）敲除或抑制与油脂合成产生竞争的其他代谢途径，扩大油脂合成的碳代谢流，如抑制合成多糖、柠檬酸的途径;（3）调控参与油脂代谢过程中转录因子活性；（4）过表达脂肪酸和三酰甘油（TAG）合成的相关基因;（5）在解脂酵母中异源表达功能性的外源基因；（6）扩大可利用底物范围;（7）设计可分泌油脂到胞外的新途径；（8）解耦氮源的限制，使解脂耶氏酵母在氮源存在的条件下产生大量乙酰CoA，提前积累油脂; （9）修饰氧化还原反应，提供更多的NADPH;（10）结合多组学与计算机代谢网络模型分析代谢途径，指导油脂的合成。表2汇总了采用代谢工程手段改造解脂耶氏酵母调控油脂合成的工作。

油脂降解作为油脂合成的拮抗途径，阻碍了油脂的积累，因此相关基因已成为敲除的主要目标[3，32]。例如，在工程菌株中敲除了MFE1基因产生了油脂过度积累的表型[34，35，36]。同样，负责过氧化物酶体生物合成的基因PEX3、PEX10和PEX11也被敲除，以完全取消β-氧化活性[37，38]。细胞代谢调控因子的敲除也有利于油脂的积累[39，40]。例如，SNF1缺失的解脂耶氏酵母菌株积累的FAs含量比野生型菌株高2.6倍。在一株能产生ω-3系二十碳五烯酸（EPA）的工程菌中，SNF1的缺失使得菌株的EPA效价相比对照菌增加了52%[39]。在MIG1基因缺失的菌株中也发现了类似的结果[40]。当脂质含量增加到48.7%时，MIG1基因缺失的细胞比亲本细胞显示出更多的脂质体（LBs），猜想可能是由于MIG1的缺失下调了MFE1，上调了其他与油脂生物合成相关的基因。最后，因为糖原和TAG是两个主要的碳储存单位，所以基于他们的合成相互竞争的假设， Bhutada等在糖原合成酶(GSY1)上进行了无效突变，结果与野生型菌株相比，TAG的含量增加了60%[41]。

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