研究的目的与意义

胶原蛋白是动物细胞外基质中的主要结构蛋白之一，它是由三股alpha;-螺旋结构的肽链缠绕形成的纤维状蛋白，其一级结构由（Gly-X-Y）_n重复序列组成，其中X通常为脯氨酸，Y为羟脯氨酸或羟赖氨酸。胶原蛋白具有独特的组织结构和生物学特性，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要的作用，同时胶原蛋白具有低免疫原性、可生物降解、良好的生物相容性和机械性能等特点，作为生物医用材料广泛用于医药和化妆品等领域^[1]。胶原蛋白传统的生产方法是利用酸碱法或酶法处理猪或牛等哺乳动物的结缔组织提取，但此法提取的胶原蛋白存在可加工性弱、生物活性降低、排异反应严重等问题。胶原蛋白结构为三股相互缠绕的多肽链组成的长且稳定的三螺旋结构。根据胶原蛋白的三条氨基酸链组合的方式不同，胶原蛋白被分为I、II、III等多种类型，目前已经发现28种^[2~3]。蛋白质结构由于其初级结构的组合方式不同导致其呈现不同的形态，进而表现出一些功能不同的生物学性质。早在1951年，美国的Paining便已经阐述了胶原蛋白的结构。麻省理工学院的Buehler在2006年再一次在纳米水平上详解了胶原蛋白的结构^{[4, 5]}。据研究，胶原蛋白具有一定的生物活性且不溶于水，因此一般情况下不能被蛋白酶利用，而在酸、碱、高温的条件下，会因为降解而发生性质的改变^[6]，明胶可以为蛋白酶所利用。

2.国内外同类研究

2.1人源重组胶原蛋白的生产现状及存在问题

2.1.1人源重组胶原蛋白的生产现状

胶原蛋白的生产一般是直接提取、纯化自动物组织中，大体过程是先去除油脂，再去除杂蛋白，经过析出、纯化等得到胶原蛋白。在很多情况下，单一的提取方法往往得不到预期的效果。提取的方法有：①热水提取法。热水提取法是从动物组织中提取胶原蛋白的最常用的一种方法。②酸、碱、中性盐提取法。酸、碱、中性盐提取法是指原料在酸性、碱性或中性盐环境中破坏其分子间的键和作用力，引起胶原纤维溶解的一种胶原蛋白提取方法。 ③酶提取法。酶提取法是采用不同的蛋白酶在一定的外界环境条件下对胶原蛋白进行降解，从而将末端肽切割下来，最终把胶原蛋白提取出来的一种方法^[12]。

2.1.2存在问题

用传统的提取方法提纯出的胶原蛋白存在动物源疾病的风险，制约了胶原蛋白的开发。且传统的提取方法所得到的数量有限，虽然已经有美国和日本依赖全化学合成的手段合成出类胶原蛋白，但因化学合成蛋白质技术复杂、产量少、代价昂贵和难于标准化，目前还不能应用于工业化的生产中，因此，利用基因工程方法生产重组的胶原蛋白就越来越成为现在研究发展的趋势。

基因工程方法最常用的工程菌就是大肠杆菌。大肠杆菌表达系统在培养操作上较为简单，菌种生长迅速，表达量较高且生产成本低廉，发酵周期较短，可规模化发酵培养，抗污染能力也强，且该系统包含多种宿主菌和载体，可以适应不同的表达过程。但是，由于大肠杆菌表达属于原核生物，在表达真核蛋白过程中目的蛋白常在胞内形成不溶性的包涵体，不具有生物活性。另外，大肠杆菌表达系统还具有原核表达系统的翻译后的加工修饰体系不完善、产生的致热原使胶原蛋白难以应用于临床等，也使得表达产物的生物活性较低。因此，选择合适的工程菌生产出具有生物活性的人源重组胶原蛋白，并使其高度表达，降低生产成本具有重要的意义。

2.2微生物发酵产人源重组胶原蛋白

2.2.1人源重组胶原蛋白的性质和应用

胶原蛋白是结缔组织中最主要的结构蛋白，它的基本结构是原胶原，每个原胶原分子都由三条 alpha; 肽链组成，而每个 alpha; 肽链都会形成左手螺旋，三条左手螺旋扭在一起形成一个大的右手螺旋结构。胶原蛋白的种类多，结构复杂，目前发现的胶原蛋白至少有 28 种，但其基本结构却大同小异。

胶原蛋白对哺乳动物来说十分重要且含量多，具有很多生理调节功能。主要包括： ①免疫作用。调节人体的免疫力、抗氧化等。②保健作用。降血压、防止贫血等。③美容作用。减肥、促进皮肤代谢等。④助吸收。保护胃黏膜、协助母乳分泌等。⑤其他作用。预防和治疗骨质疏松症、缓解关节疼痛等。有些研究显示，缺少胶原蛋白或蛋白分子缺失会导致人机体性能的改变，导致很多疾病的发生，比如血管基质的动脉粥状硬化、结缔组织遗传性疾病、血管和肾胶原性基底膜的糖尿病、软骨发育不良、奥尔波特综合症、角膜和晶状体异常等。

胶原蛋白在食品领域中的应用，主要包括以下几方面: 作为功能性食品和保健品，经常食用胶原蛋白丰富的食品可增加皮肤组织细胞的储水能力，增强和维持肌肤良好的弹性，延缓肌体衰老; 作为肉制品改良剂，可影响肉类的嫩度，改善产品品质，提高蛋白质含量; 作为食品包装材料，如人工肠衣等^[11]。

胶原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、生物相容性和促进血小板凝聚等生物学特性，是非常重要的天然生物材料。重组人源 I 型胶原蛋白制备成的海绵具有多孔微观结构和低炎症反应的特性，可被运用于细胞组织的再生^[6]。重组人源 II 型胶原蛋白能刺激细胞外软骨基质的更新合成，被应用于软骨再生^[7]。此外，重组胶原蛋白还被应用于混合仿生学或互穿网络支架，如制备人工角膜等^[8]。

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