HPLC法检测取代芳基甘氨酸文献综述

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文献综述

1.取代芳基甘氨酸的概况

1.1取代芳基甘氨酸的简介

在有机化学中，芳基指任何从简单芳香环衍生出的官能团或取代基。虽然更特殊的名称如苯基，被用来描述未被取代的芳基，但出于概括和简练的原因芳基仍然被使用。

最简单的芳基是苯基（Phenyl），由苯衍生而来。芳烃分子的芳核碳上去掉一个氢原子后，剩下一价基团的总称，通常用Ar表示[1]。

简单的取代芳基甘氨酸化合物结构式，如图：

图1.1芳基甘氨酸

取代芳基甘氨酸（英语：aryl-substitutedglycine）白色或类白色结晶性粉末，不溶于水、乙醇、乙醚及一般的有机溶剂。

1.2取代芳基甘氨酸的制备[4]

以最简单的芳基甘氨酸为例：

芳基取代的乙酸(Ⅰ)和R(-)-2-氨基丁醇作用生成手性噁唑啉衍生物(Ⅱ)。利用α-碳上氢原子的活泼性,(Ⅱ)与硝酸甲酯作用生成硝基噁唑啉衍生物(Ⅲ)由于手性噁唑啉的不对称诱导作用,这步反应是立体选择性反应。化合物(Ⅲ)经还原、水解生成具有光学活性的芳基甘氨酸(Ⅳ)。

1.3取代芳基甘氨酸的应用[3][5]

取代芳基甘氨酸是生产医药产品β-内酰胺类抗生素的重要中间体,同时还是合成多肽激素、多种农药的重要中间体,广泛应用于药物学领域。由于它用途广泛,合成后的医药产品即可注射又可口服,所以在医药、农药及精细化工市场前景广阔。

1.4国内外取代芳基甘氨酸现状[2]

芳基甘氨酸类产品包括苯甘氨酸与对羟基苯甘氨酸以及它们的衍生物如邓盐等,这些都是用途广泛的医药中间体。近几年来由于半合成抗生素特别是(羟)氨苄青霉素、头抱(羟)氨苄等药物的迅速发展,对其合成所用的各种中间体原料的需求量也不断上升,其中芳基甘氨酸与对羟基苯甘氨酸最引人注目。

芳基甘氨酸与对羟基苯甘氨酸均为高附加值的精细化工产品,市场前景非常好,必须注重开发。取代芳基甘氨酸生产过程中最关键的原料是乙醛酸，开发时必须重视关键原料乙醛酸供应问题,特别是乙醛酸的质量,否则严重影响下游产品的收率和纯度。中国加人WTO总体上有利于芳基甘氨酸与对羟基苯甘氨酸及下游产品的出口,因此,继续研究芳基甘氨酸与对羟基苯甘氨酸的合成过程,提高芳基甘氨酸与对羟基苯甘氨酸的生技术水平,抓好乙醛酸原料的建设,是芳基甘氨酸类产品的发展方向。

2.取代芳基甘氨酸的检测

取代芳基甘氨酸含量的测定主要有高氯酸法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法等。

2.1高氯酸法[6]

2.1.1高氯酸滴定法原理

高氯酸滴定法，其原理为酸碱中和反应。即在乙酸存在下，用高氯酸滴定样品中的取代芳香甘氨酸，并以结晶紫为指示剂，当溶液滴定至绿色时即为滴定终点。

2.1.2高氯酸滴定法操作步骤

称取试样适量含取代芳基甘氨酸的待测样品(相当于99%的取代芳基甘氨酸的待测样品0.20ɡ左右），精确至0.0001ɡ，加甲酸3mL，搅拌至完全溶解，再加冰乙酸30mL,结晶紫指示剂适量，用高氯酸标准溶液滴定试液，直至颜色变绿即为终点，记录消耗高氯酸标准溶液的体积(V1)，同时做空白试验，记录消耗高氯酸标准溶液的体积(V0)。取代芳基甘氨酸含量计算：

式中：C----滴定试液时高氯酸溶液的浓度,mol/L；

V1----试液消耗高氯酸标准溶液的体积，mL；

V0----空白消耗高氯酸标准溶液的体积，mL；

m----含取代芳基甘氨酸样品的质量，ɡ；

K----1.00mL高氯酸标准溶液（CHClO4=0.1000mol/L)相当于含取代芳基甘氨酸样品的质量,mg。同一样品进行两次测定，取平均值，结果修约到保留一位小数。

高氯酸法是一种化学滴定的方法,测定含取代芳基甘氨酸样品时，其误差较大,操作繁琐。

2.3毛细管电泳法

由20世纪80年代发展起来的新的毛细管电泳技术(CE),是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。近年来CE技术广泛应用于实验室手性拆分。

CE用于手性拆分有高效、简便、低耗等优点,其较高的分离效率使分离选择系数较小的对映体,可以得到满意的分离效果；分离模式多且变换简单,使用不同的手性选择剂或改变电解质溶液的组成,即可提高或改分离选择性；手性选择剂、缓冲液和样品消耗量少。不过,CE也存在检测灵敏度不足、重现性差的局限性。

2.3.1毛细管电泳法工作原理

以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依柱中各组分之间的淌度和分配行为的差异而实现分离。[7]

取代芳基甘氨酸是半合成β-内酰胺类抗生素的重要侧链。检测合成该物质的反应过程中，反应物、中间物和产物及其手性变化，对于提高生产水平有重要指导作用。毛细管电泳法可分离反应过程中产生的几种手性化合物。[8]

2.4薄层色谱法[9][10]

薄层色谱法（thinlayerchromatography，TLC）是20世纪50年代从经典柱色谱法和纸色谱法基础上发展起来的一种色谱技术，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱。薄层色谱法操作简便、快速、灵敏、分离效果好、显色容易，在生物化学与分析实验中广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂类、生物碱等多种物质的分离和鉴定。但在氨基酸分析实验中，常出现显色效果不好及拖尾的现象。

2.4.1薄层色谱法工作原理

薄层色谱是将固相支持物(也叫吸附剂)均匀铺在玻璃板上使之成为薄层，将待分析的样品点到薄层板的一端，然后将点样端浸入适宜的扩剂中，在密闭的层析缸中展层。由于各种氨基酸的理化性质(分子极性、分子大小和形状、分子亲和力等）不同，其在吸附剂表面的吸附能力各异。当展开剂在薄层板的毛细管中移动时，点在薄板上样品的组分就不同程度地随着展开剂移动，使不同的氨基酸得以分离。

2.4.2操作步骤

（1）薄层板的制备。①调浆：称取硅胶14g，加黏合剂25mL，置于研钵中充分研磨成均匀的膏状；②涂布：取两块洁净的干燥玻璃板（2020）置于涂布器上均匀涂层。（请询问作者2020的单位是否是20cm20cm，没有单位的数值没有意义）③干燥：将玻璃板水平放置，室温下自然晾干。④活化：晾干的薄层板置于烘箱内，105℃活化30min，切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。

(2)点样。活化后的硅胶板室温冷却后，在距底边2cm水平线上均匀确定5个点。用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面，每次加样后原点扩散直径不超过3mm，干后再点一次。

(3)展层。在层析缸中加入展开显色剂1cm厚，加盖平衡0.5h。将薄层板点样端浸入展开显色剂，展开显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层显色剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干,即可出现氨基酸显色斑点。

薄层色谱是一种氨基酸分离方法，但无法定量定性准确检测出取代芳基甘氨酸含量。

3HPLC法检测取代芳基甘氨酸

3.1HPLC简介[11]

在所有色谱技术中，液相色谱法（liquidchromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。

高效液相色谱法又称高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱、近代柱色谱等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

高效液相色谱法有四高一广的特点：高压，高速，高效，高灵敏度，应用范围广。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点。

3.3高效液相色谱法原理

高效液相色谱法是利用混合物中各组分在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，是各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。两相中有一相是固定的，叫做固定相，有一相是流动的，叫做流动相。色谱图是色谱柱流出物通过检测器时所产生的相应信号对时间的曲线，纵坐标为信号强度，横坐标为时间。在HPLC中流动相是液体，所有要分析的样品必须能溶解在流动相中，流动相带着样品与固定相做相对运动。

3.4HPLC法操作步骤[12][13]

（1）仪器与试剂的选择

（2）色谱分析条件的确定

（3）标准溶液的制备

（4）样品溶液的制备

（5）实际样品的测定

（6）数据分析

3.5对色谱条件的优化[14]

（1）流动相的选择

（2）HPLC法控制条件（如流速、时间、温度、配料比等）的优化选择

（3）流动相的回收

（4）检测波长的选择

取代芳基甘氨酸的测定采取高效液相色谱法。采用汉邦ODS-C18柱和可变波长紫外检测器，进样量10μL，对取代芳基甘氨酸进行分离和检测，确定一个良好的线性范围、回收率和相对标准偏差（RSD）。该方法简便、快速、灵敏度高、重现性好。

目前国内生产取代芳基甘氨酸企业少批量生产,其产品质量和制造成本都缺乏与国外大公司竞争的能力。随着取代芳基甘氨酸的消费量日益增加，市场需求正日益扩大，提高检测精度,提高产品质量显得越来越紧迫。因此，探索HPLC法检测取代芳基甘氨酸意义重大，具有良好的经济效益和社会效益。[15]

取代芳基甘氨酸的分析方法没有国家标准或行业规范，国内也鲜有报道。我们采用HPLC法检测取代芳基甘氨酸的含量，该方法与其他检测方法相比，操作相对方便，准确度高，为研究过程中工艺条件的优化和过程监控提供了一种非常有效的方法。

4HPLC法检测取代芳基甘氨酸的意义

(1)本法定量的依据是取代芳基甘氨酸的含量与峰面积有关,优化条件后的HPLC法避免了因吸收峰不能完全分开等影响峰强度测定的因素；(2)该法操作简单，既避免了化学滴定法等检测方法繁琐的操作步骤,又提高了实验精密度，避免了步骤过多引起的误差增大；(3)分析速度快。一旦线性关系式确定,测定一个样品只需几分钟,因此特别适用于例行分析的场合。[16]

参考文献：

(1)百度百科.芳基，甘氨酸.

(2)陆军民.国内苯甘氨酸类产品的生产与市场前景[J].浙江化工，2002，（33）:（1）

(3)AliciaBoto，RosendoHernandez，AdrianaMontoyaandErnestoSuarez.One-potsynthesisofarylglycinesandotherunnaturalaminoacidsfromserinederivatives[J].TetrahedronLetters，2002，43

(4)王素青，郭建权，尹承烈.芳基甘氨酸的不对称合成[J].北京师范大学学报(自然科学版)，1994，（03）

(5)Hui-YoungKu，JunyangJung，Soo-HyunKim，HeeYeonKim，KyoHanAhn，Sung-GonKim.Anefficientsynthesisofenantiomericallypureunnaturalarylglycinolsandarylglycines[J].ElsevierLtd，2006

（6）管有根，叶群锋.高氯酸滴定法测定掺杂味精中谷氨酸钠的含量[J].粮油食品科技，2003，（03）

（7）陶佳颐.手性化合物和毛细管电泳技术的应用[J].蚌埠医学院学报，2007,（01）

（8）杨柳，王建军，郑国钧，孙万儒.制备苯甘氨酸和对羟苯甘氨酸反应过程中有关物质的毛细管电泳手性分析[J].分析化学，2003，（03）

（9）林珊.运用薄层色谱法对氨基酸分析实验的改进[J].实践与探索，2010，（05）

（10）夏俊才.头孢氨苄的薄层鉴别和相关物质检查方法的探讨[J].安徽医药，2002，（06）

（11）百度百科.HPLC.

（12）马巧芳，曹美英.D-苯甘氨酸的手性含量测定[J].浙江化工，2002,（33）:（2）

（13）吴红，晁红霞，李晓玥，孙世民.对氯苯甘氨酸高效液相色谱分析[J].农药分析，2013,08，（04）

(14)屈天尧，马莉莉，王德海，吴晓波.高效液相色谱法同时测定多种杀虫剂的有效成分[J].云南化工，2014，（08）

（15）祁东玲.液相色谱法测定DL对羟基苯甘氨酸拆分体系中有效成分含量[J].科技情报开发与经济，2003，（11）

（16）沈漪,方文仅,陈日南.苯甘氨酸对映体的高效液相色谱分离[J].化学世界，2000，（08）