节杆菌腺苷酸环化酶基因的异源表达及重组酶酶学性质文献综述

 2021-09-25 20:37:13

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1 环磷酸腺苷简介环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)是一种具有强生物活性的化合物，分子量329．2，具有一个由单核苷酸AMP分子中的磷酸与核糖环化而成的特征性的3，5．环式结构。如图所示，一个cAMP分子由一个腺嘌呤、一个核糖以及一个磷酸根化合而成。成品为白色或类白色粉末，无臭，可溶于水，几乎不溶于乙醚、乙醇，对酸、碱、热相当稳定[1]，在强烈条件下水解能使5位上的酯键断开而失活。cAMP有许多衍生物，如6一氨基和2'-O位上发生取代形成的一系列酞基衍生物[2]，其中双丁酞基衍生物(即DBcAMF)常用于近代研究和临床治疗，cAMP衍生物的生物活性比其母体更强[3]。

2 腺苷酸环化酶简介腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，EC 4.6.1.1，简称AC）催化ATP生成cAMP和PPi，是生物合成cAMP的关键酶。腺苷酸环化酶在人体、动物、高等植物和细菌中普遍存在。它在这些生物细胞内的分布几乎无处不在，存在于细胞的原生质膜、线粒体、内质网、微粒体。由于此酶的活性通常很低，因而ATP转变成cAMP的速度也很慢。但是腺苷酸环化酶的活性能被体内很多激素所激活，激活机制一般设想为在激素和腺苷酸环化酶之间或在激素与腺苷酸环化酶有关的膜之间存在着一个相互变构作用(图)。当机体内外的某些刺激引起某些激素分泌并进入血流作用于靶细胞时，这些激素便分别结合在靶细胞外面的特异受体位置上，各个靶细胞膜具有识别相应激素的受体。激素和特异性受体结合形成复合体，激活细胞膜上的G蛋白，被激活的G蛋白再激活细胞膜上的腺苷酸环化酶，催化ATP脱去一个PPi而生成cAMP。生成的cAMP作为第二信使通过激活APK(cAMP依赖性蛋白激酶)，使靶细胞蛋白磷酸化，从而调节细胞反应，指令细胞以特定方式起反应。cAMP最终又被磷酸二酯酶水解成5'-AMP而失活。腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶从两个不同方面调节细胞内cAMP浓度，从而影响细胞、组织、器官的功能。

3 腺苷酸环化酶在cAMP生产中的应用cAMP最早发现于动物体内。1963年Okabayashi等发现了一株从污水中分离得到的Brevibacterium liquefaciens sp．n．，在以氨基酸为碳源的培养基中27℃培养88 h，能分泌一种腺苷酸类物质，经过紫外光吸收光谱、红外吸收光谱、纸层析、纸电泳、氢标记、磷酸二酯酶降解等多种方法分析鉴定，确认产物为cAMP，产量约450 mol／L菌液(相当于100mol／g干细胞)，远高于动物细胞[4]。1965年，Makman等发现大肠杆菌也能胞内积累cAMP，浓度为10 mM[5]。这些发现使cAMP的生产从动物界转向了微生物界。Brevibacterium liquefaciens生长或者停止生长的细胞均能产生cAMP，且cAMP的生成都受到两种生化物质的特别控制，即氨基酸和糖类，添加氨基酸和糖类可以加速cAMP的生成[6]。氨基酸中，以丙氨酸和天冬酰胺效果最佳，糖类中，戊糖比己糖及其它糖类的效果更明显[7]。利用经氯霉素处理已停止生长的Brevibacterium liquefaciens细胞生产cAMP时发现，添加丙氨酸或丙酮酸有明显的激活作用，且丙酮酸比丙氨酸效果更好，但二者没有协同效应[8]。经研究分析，丙酮酸可轻微抑制磷酸二酯酶，同时又可激活腺苷酸环化酶，但激活效应更强；而丙氨酸不能抑制磷酸二酯酶。由此可见，丙氨酸是通过转化为丙酮酸起作用的，真正的激活剂是丙酮酸。丙酮酸主要是作为腺苷酸环化酶的激活剂增强cAMP的合成反应，而不是抑制cAMP的降解[9]。丙酮酸是微生物体内糖代谢和氨基酸代谢支路的中间产物，关于丙酮酸激活效应的原因，推测可能是因为微生物体内存在一些糖代谢和氨基酸代谢的调控机制，而cAMP作为细胞内的调控介质，会作出相应的反应，改变表达水平[10]。

4 谷氧酸棒杆菌表达体系谷氨酸棒杆菌是呈短杆状的革兰氏阳性非致病细菌，好氧，无鞭毛，不运动，不产生孢子，生物素营养缺陷型，最适生长温度 30-32oC，最适 pH 为 7.0-7.5[11]。2003年，Kalinowski J等[12]完成了谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的全基因组测序，促进和方便了国内外研究人员对谷氨酸棒杆菌进行更为深入的分子育种和代谢工程研究。随后谷氨酸棒杆菌被广泛应用于代谢工程方面的研究，通过基因工程和分子生物学手段，改造谷氨酸棒杆菌野生菌种，构建工程菌株，高效的积累我们期望的目标产物。谷氨酸棒杆菌是目前生产上应用最为广泛的氨基酸生产菌，除了氨基酸外，还用于核酸和维生素等的生产[13]。随着基因工程的发展，国内外科研工作者已成功构建了一系列谷氨酸棒杆菌的分子操作工具，同时建立了高效的异源 DNA 转移方法，通过 DNA 重组技术可以定向改造谷氨酸棒杆菌的代谢途径。目前，谷氨酸棒杆菌的载体大都源于四个质粒家族pCG1、pBL1、pCRY4 和 pXZ10142。其中构建的质粒载体大多为pCG1和pBL1的衍生质粒，以卡那霉素、氯霉素、博来霉素以及红霉素抗性作为筛选标记[14]。本研究所用的pXMJ19即源于pBLl。电转化法是目前最便捷的一种DNA 转化谷氨酸棒杆菌的方法，细胞的生理特性是影响电转化效率的一个重要因素，对数生长期初期和中期的培养物更适宜用来制备谷氨酸棒杆菌电转化感受态细胞[15]。

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