UDP-葡萄糖脱氢酶基因克隆、表达与纯化文献综述

 2021-09-25 20:45:31

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1.UDP-葡萄糖脱氢酶

UDP-葡萄糖脱氢酶（UDP-GlcDH）是透明质酸合成过程中关键的限速酶，可以将UDP-葡萄糖催化生成透明质酸必需的前体物质UDP-葡萄糖醛酸。分别采用大肠杆菌BL21（DE3）和YK537 的基因组DNA 为模板，通过PCR 获得BL21（DE3）和YK537 的UDP-GlcDH 基因ugd，并采用分子生物学方法分别将两种菌株的ugd 基因插入含有PL 启动子的pBLMVL2 载体中，分别获得重组质粒pBLBugd 和pBLYugd，再分别转化于大肠杆菌BL21（DE3）和YK537 中，获得4 株重组菌；采用升温诱导表达UDP-GlcDH，并测定不同重组菌株的UDP-GlcDH 的活性，探索出不同温度诱导条件下UDP-GlcDH 的表达量及活性差异。

1.1葡萄糖脱氢酶的酶学研究

1975年Pauly和Pfleiderer从B.megaterium中纯化了葡萄糖脱氢酶,纯化后比活为550U/mg,凝胶渗透色谱测得该酶活性形式的分子量为116kDa,0.1%的SDS和SM的尿素能使酶解聚成30kDa的单体,显示了该酶的活性形式是由4个多肤链组成。最适pH在Tris-HCI中是8.0,而在醋酸盐/硼酸盐缓冲液中则是9.0。在pH9.0时,Km(NAn )=4.5mM,Km(葡萄糖)=47.5mM。D-葡萄糖脱氢酶对D-葡萄糖高度特异,并且能以NAD 和NADP 为辅酶。该酶对琉基抑制剂,重金属离子和鳌合剂不敏感。

Boontim等从B.thuringiensis M15得到了D-葡萄糖脱氢酶,纯化后的酶SDS-PAGE显示其分子量为25kDa,该酶对葡萄糖和2-脱氧-D-葡萄糖高度特异,而对甘露糖,半乳糖,阿拉伯糖,木糖,山梨糖和鼠李糖无活性。对葡萄糖的Km和Vmax分别是14mM和355M/min/mg,且对NAD 有偏好性。最适温度是55摄氏度。最适pH是pH8.0,在pH6.0至5.0稳定,在pH7.0最稳定。化学试剂EDTA,pCMP，DEP，PGO，pMSF，1.10菲罗琳,二异丙基氟磷酸，DTT，均抑制酶活,而EDTA是最有效的抑制剂。

2.透明质酸

透明质酸（Hyaluronic Acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖与葡萄糖醛酸为双糖单位等摩尔聚合而成的酸性黏多糖，相对平均分子量多在104-107Da 之间，不同分子量的HA 具有不同的应用领域，由于HA 独特的黏弹性和生理功能，HA 已被广泛应用于医药、化妆品和食品领域。C 类的兽疫链球菌和马疫链球菌都可以合成HA，鉴于HA 在发酵液中以游离状态存在，具有易于分离纯化和工业化生产等优点，因此目前工业上主要采取发酵法获取HA。然而链球菌对于培养基营养条件要求苛刻及不同HA 分子量难于通过代谢调控获得等劣势已展现出来，以传统的工艺优化难以满足市场需求。由于基因工程手段构建工程菌表达HA 则具有成本低，便于代谢调控以及下游纯化工艺便捷等优点，已成为未来工业化获取HA 的首选方法。研究表明，has 操纵子在链球菌中的表达是合成HA 所必需的，has 操纵子是由3 个基因hasA、hasB/ugd 和hasC 组成，分别编码HA 合成酶、UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，对于HA合成代谢具有显著影响的则是hasA 和hasB/ugd 基因。将hasA 与hasB/ugd 基因导入表达菌株并在适宜的培养条件下则可获得HA。

3.UDP-葡萄糖脱氢酶合成HA

UDP-葡萄糖脱氢酶（UDP-GlcDH）存在于动物、植物与细菌中，可以将UDP-葡萄糖转化成UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA），UDP-GlcA 是形成结构多糖和细胞生长代谢必不缺少的前体物质。Sheng 等研究结果表明高活性的UDP-GlcDH 更有利于HA 的生成。PL 启动子受λ 噬菌体CI 基因的调控，CI 基因温度敏感性突变体所产生的CI857 阻遏蛋白在低温30℃时候具有阻遏作用，在高于37℃时候阻遏蛋白失活并且解除阻遏，促使PL 启动子转录。本实验室对大肠杆菌BL21（DE3）与YK537 进行ugd基因克隆，重组连接于含有PL 启动子的pBLMVL2载体上，分别将重组质粒转化到BL21（DE3）与YK537 中进行升温诱导表达，考察不同菌株的UDPGlcDH的酶活，旨在为后续利用大肠杆菌表达系统表达来自链球菌的hasA 基因以及超表达大肠杆菌ugd 基因，并最终合成HA 奠定基础。

参考文献：

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