木糖异构酶在谷氨酸棒杆菌中的克隆表达文献综述

 2021-09-27 00:06:47

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文献综述

1木糖转运和代谢途径

细菌主要通过磷酸烯醇式丙酮酸糖转运系统从胞外摄取葡萄糖、甘露糖等己糖，与之不同的是，木糖、阿拉伯糖等戊糖的运输则依靠ABC型运输载体（ATPbindingcassettetransporters）完成，此外还存在质子协同运输载体（proton-linkedtransporters）参与戊糖的转运。大肠杆菌是自然界中为数不多的具有木糖代谢途径的细菌，其木糖转运系统包括XylH（木糖透性酶）、XylF（细胞周质木糖结合蛋白）、XylG（ATP结合蛋白）和XylE（质子协同转运蛋白）。相较于ABC型转运蛋白，H -Symporter与底物的亲和力较弱，原因是前者具有更复杂的构型，未来可在这一方面通过基因工程加以修饰从而提高细菌的戊糖转运水平。

细菌主要的木糖代谢途径包含以下两步：木糖首先在木糖异构酶（xyloseisomerase，XylA，简称XI）作用下转化为木酮糖，然后再通过木酮糖激酶（xylulokinase，XylB，简称XK）磷酸化形成磷酸戊糖途径（pentosephosphatepathway）中间体5-磷酸-木酮糖。目前分离出的谷氨酸棒杆菌普遍不能代谢木糖，原因是该菌株缺失木糖异构酶的编码基因。在已完成全基因组测序和注释的谷氨酸棒杆菌ATCC13032和谷氨酸棒杆菌R菌株中，有若干蛋白质编码序列与大肠杆菌编码木糖转运蛋白的基因存在较高同源性，研究结果表明这两个菌株都能够从胞外摄取木糖，但具体的转运机制尚未明确。此外，它们有一内源性基因的编码产物在功能上与XylB相同，该基因的表达量在木糖诱导作用下可提高9倍，这表明谷氨酸棒杆菌中可能存在木糖特异性调控基因。

2通过导入xylA和xylB基因构建谷氨酸棒杆菌木糖代谢工程菌

Kawaguchi等利用高拷贝穿梭载体将大肠杆菌K-12菌株木糖操纵子中的xylA和xylB基因导入谷氨酸棒杆菌R菌株，在组成型启动子trc（来源于质粒pTrc99A）下进行表达，成功构建了能够有效利用木糖的谷氨酸棒杆菌工程菌。重组菌株CRX2能以木糖为唯一碳源进行生长，但生长速率（0.20/h）略低于在相同浓度（20g/L）的葡萄糖培养基中（0.28/h）。在含木糖（3.6g/L）和葡萄糖（3.6g/L）的混合培养基中，CRX2能将两种碳源全部利用，生长过程中没有出现二次生长现象，但对木糖的代谢水平要低于葡萄糖，其消耗两种碳源的最大速率分别为1.5mmolh-1g-1细胞干重（木糖）和2.8mmolh-1g-1细胞干重（葡萄糖），且当培养基中葡萄糖被完全利用后，重组菌株代谢木糖的速率明显加快。此外，在木糖培养基中预培养的CRX2消耗木糖的速率是在葡萄糖培养基中预培养菌株的1.4倍。

由于xylA和xylB基因都是组成型表达，且检测到的相应酶活远高于同化木糖实际所需的水平，上述实验结果的出现可能是由于葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的木糖转运系统以及木糖异构酶-木酮糖激酶下游代谢途径存在一定程度的阻遏作用。这样的调控机制就存在于大肠杆菌中，在木糖培养基中生长的E.coli，其编码木糖转运蛋白和丙酮酸激酶基因的转录水平明显高于在葡萄糖培养基中生长的菌株。

Buschke等人的研究结果也证明了上述推论，他们以谷氨酸棒杆菌内源启动子作为xylAB基因的转录、翻译起始元件，成功构建了重组菌株DAP-Xyl1。该菌株代谢利用木糖的能力同样差于葡萄糖，在含有木糖和葡萄糖的混合培养基中，DAP-Xyl1优先利用葡萄糖，当葡萄糖被消耗完全立即转向木糖的代谢，且其消耗木糖的速率随培养基中木糖浓度的降低而减慢。此外，他们的研究还发现重组菌株DAP-Xyl1在木糖发酵过程中产生的CO2明显高于以葡萄糖为碳源时。在谷氨酸棒杆菌中，木糖代谢中间产物5-磷酸-木酮糖直接进入磷酸戊糖途径的非氧化阶段，而后转化为果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸重新进入糖酵解途径。CO2的大量形成可能正是由于重组菌株戊糖磷酸途径的代谢活力有所减弱，为了维持细胞内NADPH的供给水平，大量代谢流进入三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA）所致。

3通过导入xyl1基因构建谷氨酸棒杆菌木糖代谢工程菌

真菌的木糖代谢途径与细菌不同，木糖进入细胞内后依次在木糖还原酶（xylosereductase，简称XR）、木糖醇脱氢酶（xylitoldehydrogenase，简称XDH）和木酮糖激酶作用下转化形成5-磷酸-木酮糖，而后进入磷酸戊糖途径。其中木糖还原酶产物木糖醇目前在医药、化工、食品等工业中得到广泛应用，它同时也是可利用生物质原料制取的12种高附加值产品之一。Kim等人通过将毕赤酵母（P.stipitis）基因组上编码木糖还原酶的基因xyl1导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032，成功构建了能有效利用木糖生产木糖醇的重组菌株pEKEx2-xyl1。烟酰胺类辅因子（如NADPH）是影响木糖转化为木糖醇的一个重要因素，实验结果表明在发酵木糖产木糖醇的过程中分批式补充一定量的葡萄糖，能有效提高重组菌组pEKEx2-xyl1的木糖醇产率和产量，该菌株发酵50g/L木糖可得到30.1g/L的木糖醇。考虑到葡萄糖对谷氨酸棒杆菌的木糖转运系统有阻遏作用，Kim等人又在无氧条件下进行了相同的发酵实验。pEKEx2-xyl1在整个发酵过程中的菌体浓度始终低于11g细胞干重/L，细胞生长进入平台期后仍有木糖醇生成，最终重组菌株的木糖醇产量（34.4g/L）相较于有氧条件下提高了14.3%，相应产率为0.092g/g细胞干重h。

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