目的基因的克隆与重组文献综述

 2021-09-27 00:07:16

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文献综述

基因决定着生物的性状和遗传，它在生物学中的意义是不言而喻的，从化学上来讲，基因是一段特定的具有生物功能的DNA顺序。1965年，Holley第一个阐明了酵母丙氨酸tRNA的化学结构。第二年，Khrorana立即根据这个结果可能确定出目的基因的结构，开始了酵母丙氨酸tRNA基因合成的工作。1972年体外DNA重组技术，首先在大肠杆菌中获得成功，继而扩展为其他微生物。自从Mullis于1983年发明PCR以来，科学家对基因组基因的克隆与重组的研究更是一日千里。

基因技术革命是继工业革命、信息革命之后对人类社会产生深远影响的一场革命。它在基因制药、基因诊断、基因治疗等技术方面所取得的革命性成果，极大地改变了人类生命和生活的面貌。基因工程技术诞生于20世纪70年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大的飞跃，证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源时代。人们不仅可以直接合成基因，还可以随意的对基因进行结构改造以实现高效的表达或者获得高活性的表达产物并进一步研究核酸或蛋白质的结构与功能关系。化学合成的寡聚DNA片段可作为引物，探针或接头，以用于制备cDNA，筛选克隆样品，进行样品的检测，基因定位和DNA的顺序分析，以及进行基因突变，基因转移和构建新型的运载质粒和表达质。中国科学院上海生物化学研究院就基因合成的设计与战略，合成方法和取得结果等几个方面作一简单介绍。

基因工程[1]一般包括四个方面的基本内容：一是取得符合人们的要求的DNA片段，这种DNA片段被称为目的基因[2]；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA（质粒和病毒DNA称作载体）；三是把重组DNA引入某种细胞（称为受体细胞）；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。首先，要把所需基因目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来。1968年，沃纳阿尔伯博士、丹尼尔内森斯博士和汉密尔史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶[3]能够在DNA上寻找特定的切点，认准后将DNA分子的双链交错地切断。DNA的分子链切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1976年，科学在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段[4]连接起来，修复好DNA链的断裂口。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作连接酶[5]。把拼接好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的DNA[6]片段后仍能照样复制的运载体。基因的理想运载工具是病毒和噬菌体，病毒不仅在同种生物之间，甚至可以在人和兔培养细菌细胞转移。还有一种理想的载体[7]是质粒。质粒能自由进出细菌细胞，当用分子剪刀把它切开，再给它安装上一段外来的DNA片段后，它依然如故地能自我复制。因此，它是一种理想的运载体。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就如可以愿以偿了。将目的基因与质粒经过内切酶的裁剪，然后靠连接酶的作用，将目的基因和质粒（或病毒DNA）重新组合起来形成重组DNA。重组DNA就能在质粒（或病毒DNA）的带领下进入受体细胞。

现代化工业生产中人工合成基因的方法很多，但往往过程复杂，成本较高。人工合成基因的方法是以短链寡核苷酸作为原料，经拼接组装得到长链DNA[8]。构建长度超过单一基因的长链DNA，除了传统的限制性酶消化和链接方法以外还可以通过基于BioBrick[9]和BlgBrick[10]的方法对基本片段进行拼接。八十年代中，人工合成的DNA的技术也不断改进，由最初的磷酸二脂法，磷酸三脂法，固相亚磷酸三脂法，一直到今年来广泛应用的固相二异丙基亚磷酸酰胺法。最后一种方法的出现，促进了自动化DNA合成仪器的研制，而DNA合成仪的发展也大大促进了人工合成在基因工程中的应用[5]。

基因合成的方法主要有组装PCR[11-12]，重叠延伸PCR，即OE-PCR[13]，TBIO法，PTDS法以及IOEP法。中国科学院上海生物研究工程基地从天花粉胰蛋白抑制剂-1（TTI-I）的第3位赖氨酸取代物基因合成为例，报道了另一种以单链自身3末端互补利用DNA聚合酶制备基因双链的合成方法[14]。

现在的DNA合成技术仍受到通量低，错误率高等瓶颈的制约，在大基因合成方面的应用尚不够成熟。通过各学科间的持续交叉协作，不断涌现基因合成和组装的新方法。在DNA重组，基因化学合成实验方案的设计。蛋白质工程中基因定点突变及DNA序列测定中特定引物设计等工作中，迫切需要利用计算机对DNA序列所蕴含的分子生物学信息进行处理。国外在八十年代初期就开始了这方面的研究，并开发出一系列应用软件，主要是在大、中型计算机上实现对DNA、RNA、蛋白质序列的存储检索及结构分析等。国内这方面的工作起步较晚，主要是引进国外在大、中型计算机上开发的软件。卫生部北京生物研究所和中国科学院生物物理研究所建立了基因重组和基因合成实验设计软件系统[15]，此系统由30个功能模块组成，为研究者提供了包括在DNA分子上寻找限制性内切酶位点，核酸分子片段之间同源性比较，基因化学合成的实验设计，特定顺序分析引物及核酸杂交探针的设计，阅读框的查找等功能。此系统为实验研究提供了很大的便利，能够更准确的找准酶切位点，比较基因序列，进行序列分析等。

载体构建技术是分子生物学和基因工程研究的常用技术之一，传统的载体构建方法在构建片段拼接的复杂载体时通常构建多个中间载体，需要多次连转，转化。对此，研究方法常有一步克隆法[16]和重组融合PCR法[17]。载体构建是分子生物学常规实验，其过程无非包括扩、切、连、转、筛五个步骤，虽然简单，但影响因素很多，任一步操作不当都会影响构建结果。

人工基因合成的重要意义在于可以正确地，高效地合成基因工程所需的基因，是获得在原盒中表达的多肽基因的主要途径，并可将重组DNA和表达所需的碱基顺序同时组合合成的基因中，人工基因合成有广泛的应用前途和价值。本文主要研究如何合成一段已知序列的DNA，将其连接进入载体puc57，并转化进大肠杆菌获得大量克隆以及影响连接转化效率的因素。通过基因全合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常规手段，因此，建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要。

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