辅因子对拜氏梭菌的抗逆性调控及电子传递研究文献综述

1．结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写2000字左右文献综述：

文献综述

目前，国内外资源短缺，尤其石油等不可再生能源日益减少，导致价格飞涨。丁醇具有与石油相似的性质，而作为能源成为研究热点。拜氏梭菌作为一种常见的生产ABE（丙酮-丁醇-乙醇）发酵菌株备受关注。然而，在发酵生产上从经济考虑，缩减成本占主导地位。最近，很多文献已经报道以廉价的木质纤维素（秸秆、玉米芯、玉米杆等）水解液为底物，利用拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii发酵生产ABE。然而，木质纤维原料在酸水解成碳源的同时也产生一定量的毒素物质（有机酸、酚类物质），尤其酚类物质严重抑制菌体的生长和ABE发酵，拜氏梭菌不能直接利用未脱毒的纤维素水解液，其中的酚类毒素物质导致ABE产量低，阻碍了工业化生产丁醇的发展。

根据相关文献报道，在乳酸杆菌及酵母的代谢过程中，辅因子（NADH/NAD 、NADPH/NADP ）对酚类物质（阿魏酸、香兰素、丁香醛等）转化有一定的调控作用，缓解酚类物质对菌体的毒害作用，而相对提高了产物的得率。同时，也有文献报道了在拜氏梭菌中丁香醛抑制辅酶A的活性及表达量，同样说明在拜氏梭菌中辅因子及电子传递对酚类物质有一定的调控作用。

1.1丁醇的性质

丁醇（正丁醇或1-丁醇），四碳骨架有机物，分子式为C4H9OH，分子量为74.12，无色有刺激性气味的液体；部分溶于水，可与乙醇/乙醚等其他多种有机溶剂混溶；丁醇具有比乙醇更加优越的物理和化学性质，被称为第二代生物燃料，不仅清洁、可再生而且低污染。

1.2丁醇的用途

丁醇具有与石油相似的性质（辛烷值、热值），且与汽油兼容性好，不需改造汽车，而被认为是下一代主要的动力燃料之一，作为能源备受关注。丁醇也是一种非常重要的化工原料，主要用于生产1,2-苯二甲酸、脂肪族二元酸和磷酸的正脂类增塑剂，生产各种塑料和橡胶制品。

1.3丁醇发酵及原料

丁醇生物法合成主要是通过产溶剂梭菌Clostridia（丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、多糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌）利用碳源进行厌氧发酵（简称ABE发酵）。随着粮食资源的短缺，传统的丁醇生物发酵（小麦、玉米、马铃薯、小麦等农作物作为原料）已向生物质原料发酵（秸秆、玉米芯、玉米秆、甘蔗渣作为原料）转化。目前国内外学者对木质纤维素发酵生产丁醇做了大量的研究。Formanek通过诱变选育出的C.beijerinckiiBA101，丁醇产量达到19g/L，相对于出发菌株C.beijerinckiiNCIMB8052提高了1倍，且发现此菌株也具有利用生物质原料生产丁醇的良好性能；Wang等研究了ClostridiumacetobutylicumATCC824利用脱毒的玉米秸秆水解液进行丁醇发酵，丁醇产量达到8.3g/L；Qureshi等也研究了C.beijerinckiiP260利用未脱毒的大麦秸秆酸解液进行丁醇发酵，总溶剂产量仅为7.09g/L。由此可见，在纤维素水解液作为底物发酵的过程中，酚类物质严重抑制了丁醇的生产，尤其在未脱毒的纤维水解液中。

1.4辅因子代谢在丁醇发酵中的调控

拜氏梭菌经历两阶段（产酸期和产醇期）发酵生产丁醇。产酸期产生大量的乙酸和丁酸，合成NADH和ATP，保证菌体的能量和还原力需求；产醇期时，乙酸和丁酸被重新利用，消耗大量的还原力NADH（NADPH），开始产生丙酮、乙醇和丁醇（ABE）。目前，国内外较多学者利用基因工程技术改变电子传递路径，阻断氢气的溢出途径，降低还原力丢失，提高产醇期的还原力，从而提高丁醇的产量。

1.5辅因子代谢对酚类物质的调控

tk报道了大肠杆菌在利用NADH将阿魏酸转化为香兰素；近年来，文献报道了酿酒酵母中糠醛的还原涉及NADH，五羟甲基糠醛的还原涉及NADPH；过表达ADH6和ADH1通过提高HMF和furfural的还原力，提高产量。ZejiTC报道了高浓度的丁香醛抑制拜氏梭菌的辅酶A转移酶的活性及表达，并且设计辅酶NADH和NADPH。由此可见，辅因子代谢对拜氏梭菌的酚类物质抗逆性有一定的调控作用，通过改变辅因子代谢来改变拜氏梭菌的毒素耐受性，提高丁醇产量具有较好的发展前景。

1.6Ⅱ型内含子基因敲除技术

传统基因敲除方法是利用同源重组方法。将携带目的区域同源序列的质粒导入宿主基因组进行同源重组。但是这些改造过程因为DNA转移频率低，缺少可复制的载体和缺少可用否定选择的标记而效率低下。

近年来，梭菌的研究者们转向利用第二类内含子重新定位的方法。这种方法已经被AlanLambowitz实验室变成可能。他们定义并开发了源于Lactobacilluslactis的Ll.ltrB二型内含子，他们的发现被利用在pMTL007ClosTron质粒上。MTL007ClosTron质粒是第一种能够在不同野生梭菌中产生可遗传的突变质粒。同样关键的是ClosTron技术包含了基于ermB基因的一种转座后激活的标记（RAM）。RAM包含一种不活跃的抗生素抗性基因，在转座后(内含子插入目的位点)就变成活跃。结果就是内含子成功插入目标位点后获得红霉素抗性作为筛选标记。

由此，Ⅱ型内含子基因敲除成为一种常见的应用于丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌体系进行基因失活的技术。裴建新等人利用Ⅱ型内含子敲除系统，对丙酮丁醇梭菌的超氧化物阻遏蛋白（perR）敲除，降低了发酵过程中氧气对菌体的伤害；WangYi等人利用Ⅱ型内含子基因敲除技术，将pta（磷酸乙酰转移酶）和buk（丁酸激酶）失活，提高溶剂产量。

本实验室发现拜氏梭菌中FMN还原酶与阿魏酸（酚类物质）抗逆性有关，因此本论文将利用Ⅱ型内含子基因敲除技术将拜氏梭菌C.beijerinckiiNCIMB8052中的FMN还原酶基因（C.bei_4693）进行失活。

1.7改造后基因工程菌的验证

对抗性平板筛选出的具抗逆性和高产突变菌株进行验证。首先，在插入位点两端设计两条引物，检验PCR克隆出的片段长度，判断内含子是否插入目的位点。然后，测序验证。最后，进行回补实验，除去插入的基因序列。

参考文献

1.AntoniD,VV.Zverlov,andWHSchwarz(2007)Biofuelsfrommicrobes.Appl.MicrobiolBiotechnol77:23-35

2.谢铭，李肖．能源作物与生物能源的开发利用[J]．生物教学报，2010，35(6)：6061．

3.杨小龙，杨靖，林铁平．丁醇汽油对发动机性能影响的实验研究[J]．湖南大学学报(自然科学版)，2010，37(2)：32-35．

4.DrreP(2008)Fermentationbutanolproduction:bulkchemicalandbiofuel.AnnNYAcadSci1125:353-362

5.陈陶声，陆祖棋．发酵法丙酮和丁醇生产技术[M]．北京：化学工业出版社，1991

6.FormanekJ,MackieR,BlaschekH.EnhancedbutanolproductionbyClostridiumbeijerinckiiBA101growninsemidenedP2mediumcontaining6percentmaltodextrinorglucose[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1997,63:23062310.

7.胡翠英，李良智，朱文静，朱晨晨，周娟.同化玉米芯酸解液为丁醇[J].安徽农业科学,39(33):20459-20461.

8.杜腾飞，郭亭，汤艳，贺爱永，江岷.甘蔗渣和糖蜜混合发酵制备燃料丁醇[J].生物加工过程，10(4):13-15.

9.林有胜，王旭明，王竞，孙晓红，仇天雷，韩梅琳．玉米秸秆预处理后的酶水解及丁醇发酵[J]．安徽农业科学，37(22)：10342-10344.

10.LWang,HChen.Increasedfermentabilityofenzymaticallyhydrolyzedsteamexplodedcornstoverforbutanolproductionbyremovaloffermentationinhibitors[J].ProcessBiochemistry.2011,2(46):604-607.

11.WahlbomCF,HgerdalBH(2002)Furfural,5-hydroxymethylfurfural,andacetoinactasexternalelectronacceptorsduringanaerobicfermentationofxyloseinrecombinantSaccharomycescerevisiae.Biotechnologyandbioengineering,78(2)

12.JooR.M.AlmeidaAnjaRderTobiasModigBoazLaadanGunnarLidnMarie-F(2008)NADH-vsNADPH-coupledreductionof5-hydroxymethylfurfural(HMF)anditsimplicationsonproductdistributioninSaccharomycescerevisiae.ApplMicrobioBiotechnol.78:939-945

13.裴建新，庞浩，左文朴，林丽华，郭媛，严少敏，黄日波.(2014)perＲ基因的敲除对丙酮丁醇梭菌摇瓶发酵的影响[J].食品与发酵工业40(2)

14.YiWang,XiangzhenLi,CarolineB.Milne,HolgerJanssen,WeiyinLin,GloriaPhan(2013)DevelopmentofaGeneKnockoutSystemUsingMobileGroupIIIntrons(Targetron)andGeneticDisruptionofAcidProductionPathwaysinClostridiumbeijerinckiiAppl.Environ.Microbiol.79(19):5853.

15.方雪．利用丙酮丁醇梭菌进行木质纤维素同步糖化发酵的研究进展[J]．合肥师范学院学报，2008，26：104106．