肝素的测序
课题背景:
多糖是由多个单糖分子缩合、失水,经糖苷键结合而成的一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。多糖作为天然大分子物质同核酸、蛋白质一样是所有生命有机体的重要组成部分,在高等动物、植物、藻类以及菌类中均有存在,是自然界含量最丰富的生物聚合物,与维持生命所需的多种生理功能密切相关。因此研究多糖的结构对于解释多糖在生命体中的作用非常重要,同时,对后续深入探索体内编码多糖结构,以及控制多糖合成机制的研究也具有非常重要的意义。
由于多糖具有十分庞大的分子量和复杂的结构(包括一级结构,二级结构,三级结构和四级结构), 又分为均一多糖和不均一多糖。因此,使得学术界对多糖的研究始终处于缓步状态,现阶段多为解析简单的直链多糖。综合现有的技术及实验条件,本次实验我们选用的多糖为肝素,原因在于,一方面肝素的结构相对于复杂的多糖简单,结构基本上已知,很适合来验证我们设计的测序方案,另一方面,肝素目前在临床上有广泛的作用,具有极大的发展前景。
肝素是一类结构异常复杂的糖胺聚糖,由糖醛酸和葡萄糖胺以1,4 键连接起来的重复二糖单位组成的直链多糖混合物,含有10~30个二糖单位不等,分子量为4000~20000,平均分子量为12000,主要的单糖为6-O-硫酸-N-硫酸-alpha;-D-葡糖糖胺以及2-O-硫酸-alpha;-L艾杜糖醛酸,并由他们组成肝素的规则区。一定数目的6位无硫酸化葡萄糖胺以及2-0-硫酸-alpha;-D葡萄糖醛酸的存在,使得肝素出现10种不同的单糖(4中糖醛酸和6种葡糖糖胺)。目前文献报道水解肝素的酶主要有Heparin lyase ( Heparin lyase I、Heparin lyase II、Heparin lyase III )。目前解决肝素序列的方法主要是结合利用不同类型的酶类,同位素标记,以及荧光标记技术来对肝素结构进行测定,但是这种方法非常的复杂且只能够解决肝素的一部分结构而无法实现肝素全部序列的测定。与此同时在这种方法的测定过程中需要多种不同类型的特异性外切酶相互联合,这就使得费用上相当昂贵。
本实验先试图在肝素的基础上设计出一种能够连续测定的技术,以解决肝素的全长问题,并为后续研究提供方法基础。
拟研究的问题:
1.设计并合成一种可以与依诺肝素非还原性末端的alpha;beta;不饱和双键进行特异性结合的的荧光物质,它不但能够特异性地结合在肝素的非还原性末端,而且同时使得外切肝素酶无法识别并切割肝素。
2.对目前已有的肝素酶进行改造以期能够获得底物谱广的外切肝素酶,使其能够每隔二个单糖水解一次肝素,同时只能从肝素的非还原性末端进行切割而不能通过内切的方式进行切割。
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