超电荷聚多肽-GFP蛋白的表达纯化及其细胞摄取效率的研究文献综述

 2022-12-17 18:53:22

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、研究背景、目的及意义

随着现代生物技术的蓬勃发展，蛋白多肽类药物也随之兴起。它主要包括肽类激素、酶、细胞因子以及天然或合成的多肽。由于这些药物具有特殊的药理活性，疗效稳定、毒副作用小而且临床使用剂量小等突出特点，对肿瘤、糖尿病等疾病有着特殊的疗效，受到研究人员的广泛关注[1]。在过去的几十年内，许多有效的蛋白被发现或设计出来，取得了一些令人欣喜的成果。虽然目前已经证实了蛋白类药物对于胞外靶点的有效性，但对于一些定位于胞内靶点的蛋白如基因组编辑酶、转录因子及胞内中和抗体[2]等，研究还不够充分，因为大多数蛋白极性和分子量大，无法自发进入细胞。因此，如何使蛋白到达胞内靶点成为了一个研究热点。

目前使蛋白到达胞内靶点的形式有：递送编码蛋白的DNA序列、体外转录mRNA及mRNA类似物和直接递送蛋白。然而，编码蛋白DNA序列有外源DNA整合到宿主基因组的风险；mRNA及mRNA类似物也有较大的免疫原性及不稳定性[2]；而直接递送蛋白能增强特异性及安全性，具有广泛的适用性。综上，发展一个安全有效的方法递送蛋白进入细胞是非常有必要的。一般而言，当前递送蛋白进入细胞的方式包括机械/物理递送及基于载体的递送，机械物理递送由于低输量、具有侵袭性、需要特殊设备穿透细胞膜及只适用于体外研究等缺点，应用受到限制。基于载体的递送包括脂质体，阳离子聚合物，纳米颗粒，多肽[3]等，其中肽类载体因其具有良好的生物活性，生物可降解性，生物相容性的优势而受到广泛研究。本课题组研究的超电荷聚多肽递送系统是肽类载体的一种。超电荷聚多肽由天然氨基酸构成，因此它具有生物可降解性，没有肾脏堆积的风险，没有毒性的代谢过程；另外它由DNA序列编码，因此可精确调控序列和长度，可选择连接位置，通过发酵大规模生产。本课题在前期成功构建的超电荷聚多肽与GFP融合蛋白的重组质粒基础上，对240个氨基酸的超电荷聚多肽与GFP融合蛋白进行表达以及纯化条件的摸索，得到较高纯度的超电荷聚多肽与GFP融合蛋白，再通过荧光显微镜、流式细胞术等来研究该蛋白对不同细胞的摄取效率，为后续的研究打下基础。

二、课题研究的主要内容

本次实验在成功构建超电荷聚多肽与GFP融合蛋白的基础上，对240个氨基酸的超电荷聚多肽与GFP融合蛋白进行表达以及纯化条件的摸索，得到较高纯度的超电荷聚多肽与GFP融合蛋白，通过荧光显微镜、流式细胞术等来研究该蛋白对不同细胞的摄取效率，为后续的研究打下基础。主要研究内容包括：

1.超电荷聚多肽与GFP融合蛋白的表达及纯化

1.1 超电荷聚多肽与GFP融合蛋白的表达：菌体复苏后以1:100接种于锥形瓶中，37℃，220rpm培养4h后，1% IPTG 16℃，220rpm诱导过夜后收菌，于-20℃保存。

1.2 超电荷聚多肽与GFP融合蛋白的纯化：菌体超声破碎后取上清，通过镍柱，利用咪唑浓度梯度洗脱，初步纯化带标签的目的蛋白；镍柱纯化后的目的蛋白再通过阳离子交换柱获得较高纯度的目的蛋白。

2.超电荷聚多肽与GFP融合蛋白的表达及纯化细胞摄取效率研究

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