石斛夜光丸中原料药材的分子鉴定文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

本次课题选取中成药石斛夜光丸为研究对象，对其中的人参成分进行分子鉴别。石斛夜光丸( 简称石斛丸) 是古老的传统名方，也是现代临床应用活跃的中成药。尤其作为中医眼科著名成药, 有滋阴补肾、清肝明目的功效, 对白内障、光眼( 阴虚阳亢证),视神经炎等多种眼疾有著疗效。本品为药典方, 由石斛、人参、水牛角、山羊角等25味中药组成, 人参是主药之一, 约占处方总量的10 %。根据药典收载及相关研究，其中的原料药材如黄连，枸杞子、决明子、五味子、天冬、苦杏仁、山羊角等通过显微观察其细胞形态来鉴别，另黄连，川穹，决明子等通过薄层色谱法与标准品对比做鉴别；对人参的鉴别主要是以其主要成分人参皂苷为指标通过薄层色谱法来鉴别，然而薄层色谱法主要依据化学成分的有无,因此并不能客观、准确的对成药中原料药材的基原进行鉴别。

中药材的分子鉴定方法是建立在遗传基因差异基础之上的技术,不受环境因素对药材原植物的影响,也不受药材加工炮制后外观、性状改变的影响,排除了鉴定者个人主观因素，具有鉴定结果重复性好、方法通用性好，易于推广和标准化等优点，对近缘中药材品种的鉴定具有独特的优势。近年来,限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)、聚合酶链式反应(PCR)、随机扩增多态DNA(RAPD)、任意引物-PCR( AP-PCR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、DNA 测序等分子标记技术已广泛应用于近缘生药品种的鉴定研究, 成为传统鉴别方法的有益补充, 并取得了显著的效果。

此次研究拟采用分子鉴定的方法更加客观准确的对石斛夜光丸中的人参成分做出鉴别。

课题研究手段参照中国药典2015版《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》

1.石斛夜光丸中人参基因组的提取。中成药所含成分不同于生药材，由于经过了许多处理过程，使得药材DNA 分子受到一定程度的破坏，将直接影响DNA 模板质量，并且成药中所含成分众多，来源十分广泛，有动植物细胞，在DNA提取过程中会相互影响严重干扰基因组的质量且辅料很多也会对基因组的提取造成影响，因此基因组提取难度较大且提取到的基因组质量不高，这也是中成药成分分子鉴别的难点。

2.根据人参属特异性序列（符合PCR操作条件）寻找人参属植物的通用引物并由引物公司合成冷冻保藏。

3.设计PCR反应体系，进行预实验，根据凝胶电泳的结果判断引物的选择是否合理，PCR反应条件是否合适。（引物不合适应寻找新的引物并更换）

4.改进PCR反应体系如引物浓度，模板浓度，聚合酶用量以及PCR反应条件（变性，退火的温度及时间）

5.在实验条件允许的最佳反应条件下得出PCR扩增产物并与人参标准品做对比。

用石斛夜光丸的主要生产厂家（浙江天一堂、诺得胜、北京同仁堂、南京同仁堂、雷允上）

的产品进行平行实验来判断分子鉴别石斛夜光丸中人参成分的可行性。

文献综述：

随着中药产业现代化的发展和中成药质量的提高，对中成药鉴定技术的要求更加科学、严密和客观。但中药材品种繁多，习用品、代用品以及多基原、同名异物、同物异名等现象一直是影响中药安全性、有效性的重要问题。中国药典上收载的用于中成药鉴别的主要方法有薄层色谱法、显微鉴定法、荧光法、沉淀法、显色法、升华法、结晶法等。其中薄层色谱法由于其简便易行,在药典上被普遍采用,如复方丹参滴丸、复方鱼腥草片等均采用该方法进行定性鉴别。然而薄层色谱法主要依据化学成分的有无,因此并不能客观、准确的对成药中原料药材的基原进行鉴别。DNA条形码技术是近年来国际上新发展起来的生物物种鉴定技术，在生物物种分类与鉴定研究领域得到了迅速应用。该技术利用短的、标准的DNA序列可为动植物来源的中药材提供快速、准确的鉴定。因具有不受环境因素的影响以及样品形态和材料部位的限制，可弥补传统鉴定方法的不足，正在逐渐成为一种有效的鉴别手段。

一．石斛夜光丸( 简称石斛丸) 是古老的传统名方，也是现代临床应用活跃的中成药。由于它的独特疗效，产品甚至远销海外，该制剂是影响深远的出口名药。石斛夜光丸是临床应用和市场开发都有着光明前景的药物。尤其作为中医眼科著名成药, 有滋阴补肾、清肝明目的功效, 对白内障、光眼( 阴虚阳亢证),视神经炎等多种眼疾有著疗效。本品为药典方, 由石斛、人参水牛角、茯苓、川穹等25味中药组成, 人参是主药之一, 约占处方总量的10 %。根据药典收载及相关研究，其中的原料药材如黄连，枸杞子、决明子、五味子、天冬、苦杏仁、山羊角等通过显微观察其细胞形态来鉴别，另黄连，川穹，决明子等通过薄层色谱法与标准品对比做鉴别；对人参的鉴别主要是以其主要成分人参皂苷为指标通过薄层色谱法来鉴别。然而薄层色谱法主要依据化学成分的有无,因此并不能客观、准确的对成药中原料药材的基原进行鉴别。

二. 分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成，因此一定长度DNA 序列能够区分不同物种。中药材DNA 条形码分子鉴定是以ITS2 为主体条形码序列鉴定中药材的方法psbA-trnH 为辅助序列，符合中药材鉴定简单、精确的特点，有明确的判断标准，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定。但ITS /ITS2 序列由于进化速率快、引物通用性好、NCBI 数据库中收录的序列数量多、可以提供丰富的特异位点和信息位点等特点，在药材DNA 条形码鉴定中具有优势，但真菌和细菌基因组中也存在ITS /ITS2 序列，中药材在生长、采收、炮制加工及贮藏等环节都易受到微生物污染。在药材DNA 条形码鉴定中，由于微生物污染及药材DNA 降解严重，导致PCR扩增产物中即包括药材的ITS /ITS2 序列扩增psbA-trnH， rbcL，matK 外，来源于叶绿体的trnL-trnF 条形码已成功用于罗布麻、黄芩和何首乌等药材的鉴定。有研究表明，trnL-trnF 序列可以鉴定人参和西洋参。因此，推荐trnL-trnF 序列作为人参和西洋参鉴定的补充条形码，用于微生物污染及药材DNA 降解严重的人参和西洋参药材。

三.分子鉴别法在植物鉴定中应用较早且较多,但主要用于中药材的鉴定，在成药方面的研究还很少。有研究选用连翘败毒丸作为研究对象探讨分子标记技术在成药鉴定方面的应用，该实验采用改良CTAB法提取其总DNA, 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) 分别对psbA-trnH 和rbcL两个叶绿体序列进行梯度扩增,将扩增产物与pEASYTM-T5 vector连接后,转化到大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞中,挑取单克隆,并选择阳性克隆进行测序。所得序列校正、比对后,进行BlastN 比对分析,同时采用MEGA 4.0软件构建系统聚类树。结果表明,通过psbA-trnH序列分析可以鉴定出9种原料药材, rbcL序列分析可以鉴定出6种原料药材。此研究结果说明采用分子技术鉴定中成药成分具有一定的可行性。

五加科人参属植物人参Panax ginseng C.A．Mey.、西洋参Pana quinquefoliun L.、三七Panaxnotoginseng( Burk.) F.H Chen 等具有悠久的药用历史和良好的医疗保健作用。其药性、归经及功效有一定差异，但其饮片性状、显微特征相似，国产西洋参更难与人参区分。DNA 分子标记技术是近二十年来兴起并不断发展和完善的新检测技术。能够从分子水平上客观地反映待测材料基因片段之间的差异，鉴别结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响，一般通过杂交或电泳等方式就能直观地体现出来，结果更为准确可靠。如Shaw 等采用RAPD法明显地区分开人参属的3种药材及4种伪品。此外，APPCR法、直接测序法、PCR-SSCP法、多重PCR法等技术也被应用在人参属药材的鉴定中。

由于在提取中成药或含中药材保健品的DNA过程中遇到困难，因此需要优化实验条件。有研究在使用传统CTAB 法提取人参类成药制剂并对其进行分子鉴定时，因为DNA 提取困难，无检测结果，其剂型主要为颗粒剂、粉剂。经过分析，发现其原因在于中成药中所含的淀粉与CTAB 在加热条件下反应生成高极性富含正电荷的复合物，并影响了的DNA 沉淀效果，进一步发现用甲醇处理可以有效去除这种复合物的影响。此研究为本次课题的DNA提取操作提供了参考。

四．本次课题拟选择两组引物进行人参基因组的扩增。针对人参ITS2 序列ETS基因设计的特征引物序列RS-124F 5ATAACAATACCGGGCTGATTC3,RS-324R 5GCCAGTTAAGGACAGGAG3，可得388bp的特征条带。 另一人参特异性通用引物来源于基于改良ERIC-PCR技术快速鉴别人参和西洋参的研究，该研究通过ERIC-PCR技术找到鉴别西洋参和人参的一对特异性引物ER1和EL2，RS-ER1 5-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAG-3；RS-EL2 5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCC-3，当退火温度为46.0 ℃时，人参的PCR产物有一条特异性条带，其长度为3.4 kb。通过这对引物可以准确的对人参和西洋参混合物中的人参或西洋参进行定量。

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