具DNA切割酶活性AGO蛋白的表达纯化及活性验证文献综述

 2023-10-07 08:37:37

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文献综述

基因编辑是一种对基因组及其转录产物进行定点修饰、定向敲除或插入目的基因的基因编辑技术。近年来，基因编辑技术发展日新月异，极大地推动了基因功能研究进程。目前基因组编辑新技术主要包括以下几种 ：人工核酶介导的锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（Trans cription activator-like effectors nuclease，TALEN） 技 术 、成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9）技术、CRISPR/Cpf1技术、Ago/gDNA 技术以及结构引导的核酸酶（Structure-guided nuclease，SGN）技术。[1]本文先大致回顾各种基因编辑技术，然后重点叙述本课题的方向：Ago/gDNA技术。

CRISPR/Cas9：由规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)和 CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein) 组成的CRISPR-associated系统是细菌一种重要的获得性免疫系统。[2]改造后的CRISPR-Cas9系统可在真核生物和原核生物、病毒等基因组内实现目的基因的插入、敲除。尽管由于特异性地受到单链引导RNA（single guide RNA, sgRNA)识别序列的限制，同时一些物种基因结构存在复杂性和特异性，在基因编辑过程中会出现脱靶现象，在一定程度上限制了CRISPR-Cas9系统更加广泛的应用。但是，CRISPR-Cas9系统已经展现出很强的基因编辑能力，是一项极具有应用潜质的新技术。

CRISPR/Cpf1：张锋团队并不满足于CRISPR/Cas9系统尚不完美的现状，因此继续在CRISPR 家族内寻找更加完善的基因编辑工具酶，最终发现了基因编辑效率较高的 Cpf1 蛋白，它属于CRISPR/Cas 蛋白家族的Ⅴ型[3]。CRISPR/Cpf1 系统中的 Cpf1 蛋白为三角形单体[4]，具有结合 crRNA 和切割靶序列的能力。与 CRISPR/Cas9 系统不同，CRISPR/Cpf1 系统中 crRNA 的形成不需要 tracrRNA 和 RNase Ⅲ核酸酶的参与。已有研究证明 CRISPR/ Cpf1系统的脱靶率远远低于 CRISPR/ Cas9 系统[5] 。

SGN：以 ZFN 和 TALEN 为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑，ZFN 与 TALEN 都依赖Fok Ⅰ核酸内切酶的存在。对于ZFN，每个Fok I 单体与1个ZFP（Zinc finger protein，ZFP）相连构成1个ZFN，并识别特定的位点，当2个识别位点相距恰当的距离时（6～8bp），2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，形成双链断裂，从而介导DNA定点剪切。在 TALEN 技术中，负责切割靶序列 DNA 的功能元件仍是 Fok Ⅰ核酸酶的切割区，只不过将特异性识别靶序列的定位元件替换成了一段人造的 TALE[6][7]，TALEN由于具有一些比ZFN更优越的特点，现在成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。是目前较有发展前景的基因修饰技术。

Ago/gDNA：本课题正是关于Ago蛋白的相关实验，因此主要阐述基因编辑技术中关于Ago/gDNA编辑系统的部分。限制性酶是一种能够识别特定DNA序列并在识别位点或其附近切断DNA的细菌蛋白质。它们于20世纪60年代末在细菌中被发现，自20世纪70年代初以来已成为重组DNA技术的基石。迄今为止，已鉴定出3600多种特异性大于250的限制性酶，其中的250种以上可用于分子生物学中的常规用途。它们中的大多数（即II型限制酶）只识别短DNA序列（4至8碱基对），这显著限制了它们在重组DNA技术中的应用。[8]为了克服这一限制，蛋白质工程被用来改变自然发生的限制性酶的序列特异性，但成功率有限。或者，通过将DNA结合域融合到核酸酶域，例如，锌指核酸酶（ZFNs）[9]和转录激活物，如E-ector核酸酶，（TALENs）[10]。或在体外使用成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9）[11]来产生人工限制酶（ARES）。这类酶的特异性高于天然限制酶。然而，它们并没有产生明确的粘端或钝端，这是限制性酶的一个标志，并且由于它们的单个或极低的转化率表现出相当差的活性。而且，很难从大量和纯度上获得它们。所有这些限制都显著地限制了它们在体外的应用。

Ago(Argonaute)蛋白是一类能结合短核苷酸并容易被保存的蛋白质。在真核生物中，Argonaute蛋白是RNA沉默机制的关键参与者。真核生物能够结合小RNA分子，并能作为引导性内切酶，在特定位置切割与其结合的RNA引物互补的靶RNA分子。在原核生物中，目前最具特征的Argonaute蛋白被认为在宿主防御侵入性遗传因子方面具有作用。不同于真核生物，一些原核生物有能力使用小DNA分子而不是RNA作为切割ssRNA或ssDNA靶的引物。

本课题所使用的Ago蛋白，是一种以同源DNA为靶点的DNA引导核酸酶（771个氨基酸），在87到99.9°C的温度范围内最为活跃。它利用5-磷酸化的DNA小分子来切割单链DNA靶点，而不利用RNA作为靶点。我们试图利用这一原核DNA可编程核酸酶系统来产生一类新的ARES，它能够识别和切割几乎任意位置的DNA序列，并产生不同长度的粘端。我们的策略是通过在高温下培育DNA样本来分离双链DNA（圆形或线形）。在双链DNA完全或部分解链后，PfAgo将使用两个不同的磷酸化DNA引物，将两条DNA链定位在所需的位置，并在不同的体系中切割这些链。一旦每一条DNA在所需的位置被切割，这两条DNA就可以重新连接生成所需的被切割的dsDNA。[8]

步骤1：通过在高温（87-98 C）下培养反应混合物，dsDNA靶完全或部分变性。PfAgo蛋白结合5-磷酸化的ssDNA引物。步骤2:ssDNA引物将PfAgo带到相应的目标。结合后，PfAgo能够在特定位置切割每个目标。步骤3：在每一个链分裂后，PfAgo离开其目标DNA。步骤4：通过降低温度，完成两条DNA链的断裂和dsDNA的断裂。

本课题使用的Ago蛋白能够使用短磷酸化DNA guide（15nt）来切割ssDNA靶。在我们的系统中，在所有实验中使用了16个NT引物。与其他同类型原核生物蛋白一样，Ago蛋白能在guide的协助下，在其ssDNA引物的10-11nt位置之间将其ssDNA靶区切割。（图2）[12]在先前的相关实验中，该Ago蛋白被用来检验切割特异性线性化质粒的能力，Enghiad B和Zhao H使用两条DNA guide切割了线性化的pUC19质粒（由NdeI线性化），这两条DNA guide预计会产生HindIII粘性末端。切割后，纯化裂解产物，用Klenow片段聚合酶填充裂解端。产生的碎片通过平端连接与自身连接，40个组装质粒被送去进行DNA测序，进行切割位点分析。在40个质粒中，有39个质粒被正确组装，其中38个质粒在预期位置出现了分裂。

此外，Swarts, D. C等人从1 L大肠杆菌培养物中容易纯化出大于100 nmol的蛋白质（可用于25000个反应），同时已知Ago是一种多重转化酶[13]。因此，PfAgo是一种高活性和易于获得的蛋白质，可用于实际应用。

Zhao H等人研究PfAgo-ARES是否可用于聚合酶链反应（PCR）扩增的基因产物的常规克隆，有研究从恶臭假单胞菌（1kb大小）[14]中选择了二甲苯，从化脓链球菌（4kb大小）[15]中选择了Cas9基因，并以常用质粒pUC19为靶点。用XbaI、EcorI或HindIII对pUC19质粒进行线性化，然后用虾碱性磷酸酶（RASP）脱磷。上述每一个基因均用引物进行PCR扩增，扩增后的PCR产物用Ago蛋白和两条DNA guide消化，在相同的实验中，这种效率与天然限制酶相当。

将Ago蛋白用作设计限制酶的一个优点是，与PfAgo产生双链断裂需要两个导向器的存在，两个引物在彼此靠近的位置瞄准两条不同的DNA链。如果反应混合物中没有一个引导物，那么PfAgo就不能切割dsDNA，只会在靶上留下一个缺口。

目前的研究表明，Ago/gDNA 系统已经展现出了极强的发展潜力，但还无法用于哺乳动物细胞的基因编辑，建议继续进行以下尝试：可以对 Ago蛋白的结构进行改造， 使其可以在 37℃下工作。另外，可以继续从非嗜热菌中发掘可以进行基因编辑的 Ago 蛋白。

基因编辑技术极大地推动了整个生命科学领域的研究。随着对各种基因编辑工具的不断改进，人们对生命奥秘的研究也更加深入，不过想要真正将其应用于临床治疗造福人类还需做出更多的努力。

参考文献：

[1]刘玉彪,许馨,曹山虎,孙绍光.基因编辑技术最新研究进展[J].生物技术通报,2017,33(06):39-44.

[2] 孙伟,刘杉杉.CRISPR-Cas9基因编辑系统研究进展[J].动物医学进展,2018,39(08):93-96.

[3] Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system［J］. Cell, 2015, 163（3）：759-771.

[4] Dong D, Ren K, Qiu X, et al. The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA［J］. Nature, 2016, 532（7600）： 522-526.

[5] Kim D, Kim J, Hur JK, et al. Genome-wide analysis revealspecificities of Cpf1 endonucleases in human cells［J］. Nat Biotechnol, 2016, 34（8）：863-868.

[6] Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering［J］. Cell, 2014, 157（6）： 1262-1278.

[7] Meister G. Argonaute protein ：Functinal insights and emerging roles［J］. Nat Rev Genet, 2013, 14（7）：447-459.

[8] Enghiad B, Zhao H,Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes. 2017 May 19;6(5):752-757. doi: 10.1021/acssynbio.6b00324. Epub 2017 Feb 6.

[9] Tovkach, A., Zeevi, V., and Tzfira, T. (2011) Expression, purification and characterization of cloning-grade zinc finger nuclease.[J]. Biotechnol. 151 (1), 18.

[10] Sun, N., and Zhao, H. (2013) Transcription activator-like effector nucleases (TALENs): a highly efficient and versatile tool for genome editing. Biotechnol. Bioeng. 110 (7), 181121.

[11] Wang, J. W., Wang, A., Li, K., Wang, B., Jin, S., Reiser, M., and Lockey, R. F. (2015) CRISPR/Cas9 nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning. BioTechniques 58 (4), 16170.

[12] Swarts, D. C., Jore, M. M., Westra, E. R., Zhu, Y. F., Janssen, J. H., Snijders, A. P., Wang, Y. L., Patel, D. J., Berenguer, J., Brouns, S. J. J., and van der Oost, J. (2014) DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature 507 (7491), 258261.

[13] Swarts, D. C., Hegge, J. W., Hinojo, I., Shiimori, M., Ellis, M. A., Dumrongkulraksa, J., Terns, R. M., Terns, M. P., and van der Oost, J. (2015) Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease that targets cognate DNA. Nucleic Acids Res. 43 (10), 51209.

[14] Ingram, C., Brawner, M., Youngman, P., and Westpheling, J. (1989) xylE functions as an efficient reporter gene in Streptomyces Spp-use for the study of galp1, a catabolite-controlled promoter. J. Bacteriol. 171 (12), 66176624.

[15] Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., and Charpentier, E. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337 (6096), 816 821.

资料编号：[672500]

文献综述

基因编辑是一种对基因组及其转录产物进行定点修饰、定向敲除或插入目的基因的基因编辑技术。近年来，基因编辑技术发展日新月异，极大地推动了基因功能研究进程。目前基因组编辑新技术主要包括以下几种 ：人工核酶介导的锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（Trans cription activator-like effectors nuclease，TALEN） 技 术 、成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9）技术、CRISPR/Cpf1技术、Ago/gDNA 技术以及结构引导的核酸酶（Structure-guided nuclease，SGN）技术。[1]本文先大致回顾各种基因编辑技术，然后重点叙述本课题的方向：Ago/gDNA技术。

CRISPR/Cas9：由规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)和 CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein) 组成的CRISPR-associated系统是细菌一种重要的获得性免疫系统。[2]改造后的CRISPR-Cas9系统可在真核生物和原核生物、病毒等基因组内实现目的基因的插入、敲除。尽管由于特异性地受到单链引导RNA（single guide RNA, sgRNA)识别序列的限制，同时一些物种基因结构存在复杂性和特异性，在基因编辑过程中会出现脱靶现象，在一定程度上限制了CRISPR-Cas9系统更加广泛的应用。但是，CRISPR-Cas9系统已经展现出很强的基因编辑能力，是一项极具有应用潜质的新技术。

CRISPR/Cpf1：张锋团队并不满足于CRISPR/Cas9系统尚不完美的现状，因此继续在CRISPR 家族内寻找更加完善的基因编辑工具酶，最终发现了基因编辑效率较高的 Cpf1 蛋白，它属于CRISPR/Cas 蛋白家族的Ⅴ型[3]。CRISPR/Cpf1 系统中的 Cpf1 蛋白为三角形单体[4]，具有结合 crRNA 和切割靶序列的能力。与 CRISPR/Cas9 系统不同，CRISPR/Cpf1 系统中 crRNA 的形成不需要 tracrRNA 和 RNase Ⅲ核酸酶的参与。已有研究证明 CRISPR/ Cpf1系统的脱靶率远远低于 CRISPR/ Cas9 系统[5] 。

SGN：以 ZFN 和 TALEN 为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑，ZFN 与 TALEN 都依赖Fok Ⅰ核酸内切酶的存在。对于ZFN，每个Fok I 单体与1个ZFP（Zinc finger protein，ZFP）相连构成1个ZFN，并识别特定的位点，当2个识别位点相距恰当的距离时（6～8bp），2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，形成双链断裂，从而介导DNA定点剪切。在 TALEN 技术中，负责切割靶序列 DNA 的功能元件仍是 Fok Ⅰ核酸酶的切割区，只不过将特异性识别靶序列的定位元件替换成了一段人造的 TALE[6][7]，TALEN由于具有一些比ZFN更优越的特点，现在成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。是目前较有发展前景的基因修饰技术。

Ago/gDNA：本课题正是关于Ago蛋白的相关实验，因此主要阐述基因编辑技术中关于Ago/gDNA编辑系统的部分。限制性酶是一种能够识别特定DNA序列并在识别位点或其附近切断DNA的细菌蛋白质。它们于20世纪60年代末在细菌中被发现，自20世纪70年代初以来已成为重组DNA技术的基石。迄今为止，已鉴定出3600多种特异性大于250的限制性酶，其中的250种以上可用于分子生物学中的常规用途。它们中的大多数（即II型限制酶）只识别短DNA序列（4至8碱基对），这显著限制了它们在重组DNA技术中的应用。[8]为了克服这一限制，蛋白质工程被用来改变自然发生的限制性酶的序列特异性，但成功率有限。或者，通过将DNA结合域融合到核酸酶域，例如，锌指核酸酶（ZFNs）[9]和转录激活物，如E-ector核酸酶，（TALENs）[10]。或在体外使用成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9）[11]来产生人工限制酶（ARES）。这类酶的特异性高于天然限制酶。然而，它们并没有产生明确的粘端或钝端，这是限制性酶的一个标志，并且由于它们的单个或极低的转化率表现出相当差的活性。而且，很难从大量和纯度上获得它们。所有这些限制都显著地限制了它们在体外的应用。

Ago(Argonaute)蛋白是一类能结合短核苷酸并容易被保存的蛋白质。在真核生物中，Argonaute蛋白是RNA沉默机制的关键参与者。真核生物能够结合小RNA分子，并能作为引导性内切酶，在特定位置切割与其结合的RNA引物互补的靶RNA分子。在原核生物中，目前最具特征的Argonaute蛋白被认为在宿主防御侵入性遗传因子方面具有作用。不同于真核生物，一些原核生物有能力使用小DNA分子而不是RNA作为切割ssRNA或ssDNA靶的引物。

本课题所使用的Ago蛋白，是一种以同源DNA为靶点的DNA引导核酸酶（771个氨基酸），在87到99.9°C的温度范围内最为活跃。它利用5-磷酸化的DNA小分子来切割单链DNA靶点，而不利用RNA作为靶点。我们试图利用这一原核DNA可编程核酸酶系统来产生一类新的ARES，它能够识别和切割几乎任意位置的DNA序列，并产生不同长度的粘端。我们的策略是通过在高温下培育DNA样本来分离双链DNA（圆形或线形）。在双链DNA完全或部分解链后，PfAgo将使用两个不同的磷酸化DNA引物，将两条DNA链定位在所需的位置，并在不同的体系中切割这些链。一旦每一条DNA在所需的位置被切割，这两条DNA就可以重新连接生成所需的被切割的dsDNA。[8]

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