1前言
簸箕柳（Salix suchowensis）是我国特有的小灌木，主要分布在山东,河南和江苏地区，属杨柳科柳属，种质资源丰富，是进行木本植物遗传学研究的理想材料。目前，簸箕柳全基因组测序工作已经完成，为了加深人类对其的认识以及充分利用其价值，簸箕柳后续基因功能的研究开发刻不容缓。为此，我们需要建立一个高效的遗传转化体系。原生质体是一种快捷、高效的多功能实验体系，广泛应用于植物分子生物学与基因工程研究。本研究将建立簸箕柳原生质体瞬时表达体系，为促进其功能基因的研究与利用提供有力工具。瞬时表达分析不适合复杂的生物体研究，但植物原生质体顺势表达分析在研究广泛的分子机制和信号传导等方面十分有用。
2主体
簸箕柳是一种相当有发展前景的经济植物，研究价值很高。首先，簸箕柳栽种技术简单，使用最普遍的扦插技术即可大量繁殖，且在石灰质冲积土或者半沙荒地上都能生长，稍耐盐碱，对环境条件要求不严格。其次，簸箕柳的萌芽力强，生长迅速，可快速收获。另一方面，簸箕柳用途广泛，因其材质轻，易切削，干燥后不变形，无特殊气味，可供建筑、坑木、箱板和火柴梗等用材；木材纤维含量高，是造纸和人造棉的原料；柳条还可编筐、箱、帽等；柳叶可作羊、马等的饲料；还可为优美的观赏树种；簸箕柳根系发达，固土性能好，是巩固堤岸、防风固沙的良好树种。利用良好，可为沙漠化治理做出建设性贡献。
2.1原生质体制备
植物原生质体是指：利用酶解法或者机械法去除植物细胞的细胞壁后由剩余的植物细胞膜，细胞质与细胞核组成的活性原生质团部分。植物原生质体作为研究植物生理学，细胞生物学，分子生物学等方向的理想材料，主要用于细胞融合，亚细胞定位，基因表达调控和新品种选育等领域。植物原生质体因为失去了细胞壁的阻碍，所以外缘DNA，细胞器以及染色体等更易进入细胞，所以是转化受体的理想材料。本次簸箕柳的转化体系的构建就是利用其原生质体。
酶解法制备原生质体是根据植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，然后配置特异性降解细胞壁的酶溶液，以获得原生质体。常用的分离植物原生质体的酶有纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶等。一般用作制备原生质体的材料为叶片，根系，愈伤组织，悬浮系细胞等。其中由于叶片取材方便，来源广泛，叶肉细胞排列疏松易于酶解等优势成为制备原生质体的理想材料。
植物原生质体的分离是原生质体用于细胞融合，亚细胞定位，基因组编辑以及其他研究方向的基础。
在用酶法降解植物叶片的细胞壁后所得到的产物中,有未被酶分解的大于原生质体的碎片(可用孔径50—100微米的尼龙丝网或不锈钢丝网过滤除弃)以及小 的细胞和亚细胞水平的碎片:未去壁的细胞，破碎的细胞，破碎的原生质体，线粒 体和叶绿体等。在一般离心洗涤的情况下,除去这些混杂的小碎片是较困难的。目前使用的纯化方法主要有两类:一是使原生质体集中在两相界面，但用这一方法来纯化原生质体感到很不方便。另一类方法是使原生质体漂浮于蔗糖或其他溶液的表面,而使这些小碎片沉在溶液的下层，此类方法比前一类方法使用方便。但在用滴管吸取上层漂浮的原生质体时总是会吸取了较多的下层溶液,这样在重复漂浮 洗涤和最后收集原生质体时就免不了要多带一些不需要的原先的溶液,从而影响漂浮洗净的效果。为了克服上述的缺点,我们改用了通底的离心管,这种改进能提高漂浮洗净的效果,得到较纯净的，活力好的原生质体。
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