- 研究背景与意义
新疆野苹果（Malus sieversii）是我国重要的经济果树资源因其丰富的遗传多样性被誉为天然基因资源库（张艳敏，2009）。但近年来新疆野苹果制遭受到苹小吉丁虫（Agrilus mali Matsumura）和苹果腐烂病（Apple Valsa canker）迫害（刘忠权，2014），致使新疆野苹果种群面积急剧减小，遗传资源库遭到极大的破坏，严重影响了新疆野苹果自然种群的自我更新和修复（王新，2006）。因此开展新疆野苹果抗病基因资源保护和研究迫在眉睫。WRKY转录因子家族在植物病原菌免疫反应过程中发挥着重要的作用，且在植物中与其他蛋白相互作用，共同参与调控植物免疫反应（Jiang et al, 2017）。本实验旨在对转录因子MsWRKY40与MsWRKY65互作蛋白进行筛选及验证，目的为研究MsWRKY40与MsWRKY65转录因子调控新疆野苹果抗腐烂病功能研究提供科学依据，为新疆野苹果及栽培苹果的抗性分子育种打下基础。
- 课题在国内外研究现状及水平
2.1苹果腐烂病
苹果腐烂病又称烂皮病、臭皮病，研究表明，苹果腐烂病是一种由子囊菌门黑腐皮壳属引起的病害，对应的无性世代为子囊菌的壳囊孢属。主要危害结果树枝干、果实，也可危害幼树和苗木。苹果树腐烂病的发生可导致苹果树整体树势凋零、树主干和枝干枯萎死亡、最后整株死树，直至整个果园毁灭（郭书普，2010）腐烂病菌侵入苹果树皮后，产生果胶酶、异香豆素类等代谢物质，导致组织解离、细胞消解，并出现细胞坏死、细胞器凝结、细胞壁降解及质壁分离等现象，从而引起腐烂病症并使腐烂病菌在树体内繁殖(刘品贤，1995; 柯希望，2013)。发病盛期的腐烂病病斑呈红褐色、水渍状、有酒糟味，病灶组织松软，按压有汁液流出，内层发病组织呈鲜红色。发病后期，病斑呈现灰褐色或棕褐色，失水凹陷，同时产生大量黑色小颗粒状分生孢子器(罗荣华，2004)。病菌以菌丝体、分生孢子器及子囊壳在病皮及病残株枝干中越冬，第2年春遇降水产生分生孢子，其孢子靠雨水和昆虫传播，从死组织伤口、叶痕、果柄痕和皮孔等处侵入。潜伏的病菌主要在夏季树体形成的落皮层组织上扩展，发生早期病变，出现表面溃疡，再经冬、春发病盛期，到第2年果树进人生长期病势停顿，发病盛期结东，是苹果树腐烂病的一次发生过程（郭书普，2010）。雨水来临时，分生孢子器释放的分生孢子随空气中的雨水和气流进行传播，感染健康果树(Ke et al, 2013)。苹果树腐烂病的防治工作应该从以下方面展开：加强园区栽培管理、提高树体抵抗力、适时适量喷药、刮除病部、保持卫生、适时适量施肥灌溉等。目前针对腐烂病的防治措施按照防治性质划分主要包括三种方法：农业措施、化学防治和生物防治。农业上，主要通过“春灌秋控”的方式增加树皮含水量、防御冻害；通过按比例施用微量元素、增施生物有机肥、合理留果、科学修剪等方式来增强树势、增强树体抗性( 臧睿，2012；武红霞，2019)。在化学防治中，石硫合剂是使用最多的药剂，用以减少病菌的越冬数量(王磊等，2009)。同时，三唑类杀菌剂，如苯醚甲环唑和戊唑醇，也能够有效抑制腐烂病菌的生长，可作为替代品用于田间防治（郜佐鹏等，2009)。但是这些方法在有效抑制腐烂病菌的同时，也伴随着环境污染、费时费力、资源消耗等问题。于是出现了利用人工接种鉴定、休眠期和生长期枝条病斑长度之比(RLD/RLG)指标测定等方法，可以对多种苹果种质资源进行抗性评价，并得到了部分抗病资源(刘欣颖等，2011, Abe et al, 2007)。优良抗病品种的选育为腐烂病的防治工作开提供新思路。但是传统苹果选育方式，如优势杂交育种、常规杂交育种。面临亲本遗传背景较为单一、育种周期长等难等问题，选育过程极为缓慢。随着基因工程的兴起与发展，抗性分子育种能够迅速定向地培育出符合期许的新品种。因此，我们还需对新疆野苹果抗病基因进行更深一步的筛选和挖掘，从而为苹果种质改良提供优良抗病基因资源。为防治腐烂病提供技术支持与理论支撑。
2.2 WRKY转录因子
WRKY 转录因子是一种具有多种生物学功能的转录因子，广泛存在于植物及部分低等生物中(Jiang et al, 2017)。WRKY 是一类存在于高等植物中的重要调控因子。WRKY转录因子结合含W-box顺式元件的启动子来调控基因表达，参与生物和非生物胁迫的应答响应，在植物生长、发育、代谢、环境信号刺激及对病原菌的防御反应和抗病途径的调控具有极其重要的作用(Eulgem et al., 2000; Rushton et al., 2012; Chen et al., 2018)。
1994 年ISHIGURE 等从甘薯中发现第 1 个WRKY 基因家族成员 SPF1，并发现其受蔗糖和PGA 诱导表达（ISHIGURO S，NAKAMURA K. 1994）。随着研究的深入，已经在多种植物基因组中克隆和鉴定出 WRKY 类基因。植物在长期进化过程中形成了复杂的调控网络，参与植物生长发育和逆境响应，转录因子家族在该过程中起到重要作用。根据 WRKY 结构域的个数和锌指结构类型的不同，可将 WRKY 转录因子分为三大类。I 类含有 2 个 WRKY结构域和1个类锌指结构基(C–X4–5–C–X22–23–H–X1–H)；II 类只有 1 个 WRKY 结构域，锌指结构与 I 类相同。III 类含有 1 个WRKY 结构域，但类锌指结构基序(C–X7–C–X23–H– X1–C)与其它两类有异(Eulgem et al, 2000)。这两个基本结构是 WRKY 蛋白与DNA 及其它各种蛋白质结合的关键，由此形成的复杂的胁迫调控网络，在植物抗病过程中起着至关重要的作用。 DONG 等通过基因芯片技术发现拟南芥 NPRI 的表达受 WRKY 基因调控（DONG W，NITA A，XINNIAN D. A，2006）。Northern 杂交实验表明，拟南芥 74 个 WRKY 转录因子中有 49 个受 SA 或病原菌诱导表达，参与植物抗病反应。水稻 WRKY45-1 和 WRKY45-2 基因对稻瘟病抗性都起正调控作用。CHENG 等DONG W，WEAVER N D，MEENU K，2005）通过过表达和 RNAi 技术研究表明，WRKY13、WRKY42、WRKY45-2 参与水稻对稻瘟病的抗性响应，其中，WRKY42 通过抑制 JA 信号相关基因表达负调控对稻瘟病菌抗性。
2.3 WRKY 转录因子的互作蛋白
2.3.1 WRKY-WRKY蛋白互作
WRKY转录因子往往与互作蛋白协同作用执行功能。范晓江等(2018)的研究表明，拟南芥AtWRKY6具有转录抑制活性，酵母双杂交技术与双分子荧光互补技术结果分析表明，At
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