Crispr/Cas9系统介导的斑马鱼lacc1基因的定点敲除
摘要：实验以野生型（AB）和Lacc1突变型（敲除Lacc1基因WD40结构域）的斑马鱼为研究对象，设置空白对照组，以神经毒性试剂MPTP浓度作为自变量，采用行为学拍摄、生物统计等方法,用Student t-test分析P值比较研究MPTP在不同浓度下对其行为学的影响以及野生型和LRRK2突变型对MPTP反应的行为学差异，为今后斑马鱼等生物神经元缺失的研究提供实验基础。基因编辑技术是生命科学研究的重要内容本文对适用范围以及优缺点作了简单的介绍。CRISPR/Cas9系统展现出很强的基因编辑能力，是一，项极具有应用潜质的新技术。
关键词：斑马鱼;行为学拍摄;LAaccI基因;神经毒性试剂MPTP;剂量关系
文献综述
crispr/cas9技术
CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是目前用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。目前，该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。基因编辑技术是在基因组水平进行基因定点插入或缺失突变、敲除、多位点同时突变和小片段删除等精确操作的技术，是生命科学领域的重要研究内容，但在对生物基因组进行定向修饰时，该技术的打靶效率低，试验周期长，应用范围窄使对生命科学的研究受到了阻碍。随着基因编辑技术的不断发展，新型基因编辑技术通过特异识别并且裂解靶DNA双链，激发细胞内源性修复机制实现基因定向改造，提高了打靶效率，且构建成本低，应用范围广，促进了生命科学的研究进程[1]。基因敲除又叫做基因打靶，是从分子水平去除或替代一个基因，通过观察实验动物的表型，以此推测该基因的功能。利用基因敲除建立的疾病模型，通过研究动物发育过程中各个基因的功能，成为研究治疗遗传疾病的途径[2]。
2014年4月15日，获得了美国专利与商标局关于CRISPR的第一个专利授权。专利权限包括在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中使用CRISPR。这意味着拥有在除细菌之外的所有生物，包括老鼠、猪和人身上使用CRISPR的权力。斑马鱼身体延长而略呈纺锤形，头小而稍尖，吻较短，全身布满多条深蓝色纵纹似斑马，与银白色或金黄色纵纹相间排列纹路比较有条理。在水族箱内成群游动时犹如奔驰于非洲草原的斑马群，故此得斑马鱼之美称。斑马鱼和人类基因有着87%的高度同源性，作为模式生物的优势很突出，这意味着其实验结果大多数情况下适用于人体。常可用于水质环境的监测。斑马鱼也是比较好养的一种鱼。
2.MPTP加药浓度与斑马鱼行为学之间的关系
MPTP在黒质细胞内脱氢生成MPP 离子，这种离子抑制线粒体复合酶，使该细胞死亡。Schneider和Kovelowski研究表明，在幼小猴子中长期使用低剂量的MPTP能导致其较正常猴子行为学活跃性大大增加，与人幼年时患小儿多动症症状相似[25],而在小鼠中研究MPTP造成的多巴胺神经元减少与行为学关系的论文中有些显示MPTP可以在小鼠中导致活动减退（帕金森病特征）[3、4], 有些显示对于小鼠行为学特征没有影响[5]，而有些则导致行为活跃（小儿多动症特征）[6]。对于斑马鱼，每组实验所得出的结果也不相同，分别以野生型和LRRK2突变型在不同MPTP浓度下的行为学进行对比，观察43张折线图，发现每组实验在不同梯度的平均行为性是曲折的，说明MPTP药物剂量与斑马鱼行为学活跃性呈非线性关系，支持了之前MPTP在不同研究中表现出的不同行为学结果。
行为学的检测相对比较简单，是一种直观的、宏观的检测分子控制分子最终在生命体内与正常，宏观上的检测控制因子最终在生命体内与其他正常功能之间的相互协调能力的方法，在某些有限的条件下。在某些有限的的条件下，行为学检测是一种比较 经济、便捷和有效的方法，在计算机和相应软件技术的引入之后，行为学实验不仅变得简单便捷，而且可以定量或是高通量地研究行为学。行为学实验是在形态与整体的水平上研究生命活动的本质，是对形态、电生理检测的一种必要的补充，本文就斑马鱼行为学在神经领域的应用做一扼要概述。
3 MPTP加药浓度的临界值
神经毒性试剂MPTP被发现于上个世纪70年代末至80年代初[7、8]。之后在灵长类动物中的研究表明MPTP能选择性的造成大脑黑质内多巴胺细胞的缺失[9]，这也是帕金森病的一个重要病理特征。因此MPTP之后被广泛的应用于帕金森病动物模型建立，相关动物模型包括小鼠，斑马鱼等。斑马鱼(zebrafish,Danio rerio)是近年来应用越来越广泛的重要模式生物。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因同源性高达85%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似,具有饲养成本小、体积小、发育周期短、体外受精、透明易观察、单次产卵数较高等特点。所以，斑马鱼是一个合适的中枢神经系统疾病模型的高通量筛选技术平台[10]。斑马鱼模型现已广泛应用于包括发育毒性与致畸性、胚胎毒性、心血管毒性、神经毒性、肾毒性、行为毒性和生殖毒性等在内的一系列药物毒性评价中。
如果需要通过不同浓度MPTP处理斑马鱼，获得其神经元损伤后行为学数据，斑马鱼的优势十分明显：可提供大量样本以及高通量分析，样本的透明便于通过共聚焦显微镜观察多巴胺神经元的变化。在Sallinen的研究中，也出现了行为学的差距，在低浓度（100mu;m）的MPTP处理在5dpf表现为行为活跃，而高浓度的MPTP（1000mu;m）处理在5dpf表现为行为活动减退。将对斑马鱼幼鱼进行的MPTP研究文献整理。
神经毒性试剂MPTP被发现于上个世纪70年代末至80年代初[11]。之后在灵长类动物中的研究表明MPTP能选择性的造成大脑黑质内多巴胺细胞的缺失[12.13]，这也是帕金森病的一个重要病理特征。因此MPTP之后被广泛的应用于帕金森病动物模型建立，相关动物模型包括小鼠，斑马鱼等[12]。
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
