利用CRISPR/Cas 9技术敲除大豆基因进展研究
--研究综述
摘要：近年来，研究者发现CRISPR/Cas 9 系统可以用来进行 DNA 定点编辑，编辑类型包括基因定点碱基插入缺失、基因精确定点敲入、多基因或多位点同时靶向突变和长片段删除等，在生命科学研究领域引发了技术性革命[4]。CRISPR/Cas 9基因编辑技术目前已广泛应用于细胞基因编辑和基因调节、基因敲除动物模型的构建、人类疾病动物模型的治疗研究等领域。就目前国内外研究来看CRISPR/Cas 9技术发展存在不足，仍需继续完善并且在其基础上进行新的生物功能的基因编辑研究。本研究通过CRISPR/Cas 9基因编辑技术构造大豆基因定点突变体系，利用CRISPR/Cas 9技术敲除大豆基因并重新构建sgRNA的CRISPR/Cas 9载体，将新载体通过农杆菌转化法转入农杆菌中,利用农杆菌侵染对大豆进行毛根诱导,则可对大豆耐盐机制等基因的相关功能进行探究。
关键词：CRISPR/Cas 9； 基因编辑； 大豆；农杆菌转化
- CRISPR/Cas 9
1.1 CRISPR/Cas 9系统的发展历程
CRISPR/Cas 9系统的发现 1987年日本科学家在研究碱性磷酸酶编码基因时在大肠杆菌中发现编码区附近有大量的重复序列，但当时并未确定这段序列的功能。此后，科学家们在研究其他细菌的过程中，相继发现了这种类似的基因结构 。 2002年，科学家发现这些序列由长度为25～37 bp的重复序列与具有相似长度的间隔序列组成，将其正式命名为规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly inter spaced short palindromic repeats，CRISPR），且一直沿用到今天。同年，Makarova等 [5] 在CRISPR序列附近发现了CRISPR 相关蛋白（CRISPR associated protein，Cas）的基因序列，通过结构分析，发现该基因表达产物的蛋白结构与DNA解旋酶及核酸外切酶具有同源性，预测其可能具有DNA修复功能。随着测序技术的不断成熟，研究者于2005年发现 CRISPR 序列中的间隔序列（spacer）CRISPR序列可能与细菌抵御外来核酸的侵入有关和外质粒转移功能。为后续科研人员展开CRISP/Cas 9系统被应用于各种植物中奠定了一定的基础。
1.2 CRISPR/Cas 9系统作用原理
CRISPR/Cas 9系统的作用原理 CRISPR/Cas 9系统是细菌和古细菌中一种抵御外来核酸侵入的特异性的获得性防御机制。其抵御外来核酸入侵的过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰阶段。其中适应阶段是“信息处理”系统，参与的蛋白质亚基序列高度保守；而表达和干扰阶段均属于防御过程的“执行”系统，其蛋白质序列在不同种系具有较大差异性。
CRISPR/Cas系统有三种类型：Typ Ⅰ、Typ Ⅱ、Typ Ⅲ三种，I 型 CRISPR 系统是最复杂的，包含的蛋白最多，除了 Cas1 与 Cas2 蛋白外，还需要具有解旋酶和核酸酶功能的 Cas 3 蛋白（Sinkunas et al. 2011）。II 型 CRISPR 系统的 Cas9 蛋白参与 CRISPR RNA（crRNA）的成熟以及降解入侵的噬菌体 DNA 或是外源质粒（Garneau et al. 2010），该系统仅需 Cas 9 蛋白就能进行基因编辑，所以 II 型 CRISPR 系统是结构最简单、目前应用最广泛的系统。Cas 9 蛋白具有两个核酸酶结构域 HNH 和 RuvC-like，能分别切割 crRNA 的互补链和非互补链（Jinek et al. 2012）。在此基础上，人们可以对基因组的特定点进行基因打靶、基因定点插入、基因修复等各种遗传操作。III 型 CRISPR 系统包含 Cas 10 蛋白，其主要作用在 crRNA 的成熟和抵御外源 DNA 的侵入，III型 CRISPR 系统具有两个亚型：Type A 和 Type B，更加体现出 Cas 蛋白的多态性（Anantharamanet al. 2010）。本研究是利用CRISPR/Cas TypⅡ型开展进行研究。
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
