利用酵母双杂交验证植物基因相互作用研究进展
摘要：几乎所有重要的生命活动都离不开蛋白质之间的相互作用。酵母双杂交技术是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术。人们在此基础上改进并发展了许多相关技术，并在蛋白质组学、细胞周期调控、细胞信号转导等领域取得了显著的科研成果。本文就此项技术在植物研究中的应用和前景进行简单综述。
关键词：酵母双杂交; 蛋白质; 相互作用; 应用
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有重要的生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等，都离不开蛋白质之间的相互作用。1989年，由Fields[1]和Song提出并建立的酵母双杂交系统在研究蛋白质相互作用方面表现出显著的技术优势。它是一种简便、灵敏、高效的真核细胞内鉴定基因的方法，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用[2]，而且能与cDNA文库结合使用，发现新的与已知靶蛋白相互作用的未知蛋白。本文就此项技术在植物研究中的应用和前景进行综述。
一、酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。该系统功能的实现依赖于转录活化因子上两个不同且相互独立的结构域，即DNA结构域（DNA-BindingDomain，BD）和转录活化结构域（Transcription-ActivationDomain，AD）分别来完成的。前者可识别DNA上游顺式激活序列(upstream activation sequence，UAS)并使转录活化结构域定位于所调节的基因的上游，后者可同转录复合物的其他成分作用，进而启动相应基因的转录反应。这两个结构域可被人为地分离， 单独存在的BD和AD并不能激活下游基因的转录反应，只有当它们分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，才能重建发挥转录激活作用并且引起报道基因的表达。
目前，采用的酵母双杂交系统根据BD来源不同可分为真核细胞中的GAL4系统和原核细胞中的LexA系统两种。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时，首要任务是将可能存在相互作用的已知蛋白和待研究蛋白分别作为诱饵(bait)和猎物(prey),构入含有BD和AD的载体中[3]。如果诱饵和猎物间存在相互作用，BD和AD便会在空间上重新连接成统一体并与下游序列结合，表现出完整的转录活性。另外，为了使所验证的蛋白间的相互关系得到可视化，还需在GAL4 UASs和启动子的下游构建了若干个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ），以便后期可通过营养缺陷筛选和beta;-半乳糖苷酶印膜法等检测方法，来确定两个蛋白之间是否真的存在相互作用。值得注意的是，由于转录激活过程发生在细胞核，所以融合基因必须导入到报告株的细胞核内才能进行表达。而这里的报告株通常是指一些在氨基酸合成相关基因上存在不同程度改造的酵母菌株。
二、在植物研究中的应用
植物发育调控基因的研究一直是植物科学中的研究热点，越来越多的不同功能的基因得到分离，如控制发育的多种基因、调节植物抗性的基因、参与植物感受外界因子的信号传导相关基因等。酵母双杂交系统作为蛋白质相互作用最常用、最有效的工具之一，能迅速解决这些基因在生物功能上的相关性问题。目前， 酵母双杂交系统的运用主要集中在蛋白质组学的研究中，并涉及发现新的与已知蛋白互作的蛋白、鉴定两个蛋白间互作关系、确定蛋白互作区域等诸多方面。例如，利用酵母双杂交筛选大豆cDNA文库，从中获得2个具有97%同源性的蛋白P42-1和P42-2，并证得P42-2是P34Syringolide受体的第二信使的一个主要成员[4]，从而理清了Syringolide receptor P34和avrDRpg4基因间具体的信号传递机理。此外，植物生长发育又是以细胞的分裂、生长和分化为基础的，因此在细胞水平上研究植物的发育必然要涉及到细胞周期的调控和细胞信号转导。酵母双杂交技术在这两个领域上也取得了显著成效：已知控制细胞周期的关键酶是一种依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶(cyclin-dependent proteinkinase，CDK)，酵母双杂交系统则可以对与其相互作用的因子进行鉴定，进而优化CDK活性的调控机制。万曦等人[5]曾用Duplex-A酵母双杂交系统克隆植物早期结瘤素基因ENOD40的受体基因，得到5个克隆，为进一步分析根瘤形成过程中信号转导打下了基础。近年来，随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展以及这些技术在植物发育过程中的广泛应用，其应用范围逐渐被拓宽至病毒学等领域，很多病毒蛋白与宿主蛋白间的相互作用相继被确定，医学上也它用来筛选新型的具有生物活性的肽类药物、诊断试剂和其他功能性多肽。
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