一种利用高保真PCR方法制备克隆载体的方法文献综述
摘要：T载体是可以直接克隆或表达PCR产物的新型载体，重组过程中无需酶切和纯化，简便高效[1]。本文主要概述了国内外研究过程中构建T载体的方法，其中分别介绍了利用内切酶法和PCR方法制备T载体的方法。阐述了T载体在目的基因克隆、抗体库构建、某些蛋白的融合表达方面的应用以及目前T载体的商业化[1]。探讨了今后T载体的研究发展方向。
关键词：T载体； PCR； 应用
一、文献综述
0 引言
PCR是分子生物学的一项基本技术，也是目前体外扩增DNA片段最常用的方法。通过体外PCR扩增，获得目的片段，然后克隆至高拷贝载体上，获取包含插入目的片段载体的宿主细胞，扩大培养后，提取质粒，最终获得大量拷贝的目的片段[2]。抽取的质粒可以长时间保存，为下游实验研究提供了便利条件。为此，国内外很多学者探索了许多不同的克隆方法。常用的方法有非定向克隆和定向克隆[3]。定向克隆需在引物5′末端引入限制性内切酶位点，PCR产物经适当限制性内切酶酶切后产生粘端，连接到经相应限制性内切酶酶切的载体上，这种方法克隆效率非常高。但是如果酶切位点相距太近，则可能会导致酶切效率不高或酶切失败。如果保护碱基太多，可能会影响PCR扩增反应，同时也会增加不必要的费用。而这种酶切失败当时又无法鉴定，只能等到连接、转化、酶切甚至测序之后才发现，浪费了大量的宝贵时间和研究费用[4]。非定向克隆有两种方法，一种是平末端克隆法，在Klenow酶和T4 DNA聚合酶作用下修平PCR产物末端与经平端内切酶消化的载体连接，但连接效率低，仅为粘末端连接的1/50，自身环化率高且容易形成串联插入[5]。具体且成熟的克隆方法有粘末端克隆法、平端连接法、共环消解法和无连接酶亚克隆法等。每种方法都建立了相应载体，不过这些现有的克隆载体虽然都能够达到克隆的目的，但也各有一定的不足之处。例如有的载体容易自连，有的筛选阳性克隆困难，有的实验费用较高、过程复杂，并且一般情况下克隆效率低[1]。
T载体是用于直接克隆PCR产物的一种新型载体，它的分子末端各有一个3′ dT (脱氧胸苷)突出，恰好可以与PCR产物末端由于Taq DNA聚合酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的dA (脱氧腺苷)互补配对，这样可以将PCR产物以粘性末端连接的方式直接克隆到载体上[1]。但是由于商品化的T载体售价较高，在大规模建库过程中消耗巨大，花费较高，T-载体的商业化使得分子克隆变得方便、快捷，但价格昂贵、无法循环使用等不足限制了T-载体在试验中的应用[6]。本研究尝试建立一种构建T载体的方法，利用高保真PCR加内切酶法是本研究中T载体制备方法中的方向，希望可以在实验室制备克隆型T载体,使载体具有使用方便、成本低廉及连接效率高等特点, 适合经费不足或者购买不方便的偏僻地区使用，同时满足基因克隆和表达的需要，可以达到媲美商业化T载体的水平。本文综述一些T载体的构建方法及其应用。
1 T载体的构建方法
1.1 内切酶法
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