CRISPRCas13a转基因本氏烟的获得文献综述

 2022-08-17 09:52:10

CRISPR/Cas系统介导植物基因组编辑的研究进展

摘要：CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是存在于大多数细菌与所有古生菌中用来对抗侵略的外来质体或者噬菌体的外源DNA的一种后天获得性免疫系统。CRISPR/Cas系统由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palincdromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)组成。其中CRISPR/Cas9系统由单链向RNA（single guide RNA,sgRNA）和Cas9核酸酶构成，具有操作简单、特异性强、效率高、成本低、周期短、作用对象范围广等特点，已被广泛应用于植物、动物、微生物、甚至人类细胞的临床研究中。本文阐述了CRISPR/Cas系统的发现、组成、作用机理及CRISPR/Cas系统在植物方面的研究进展及前景。

关键词：CRISPR/Cas系统；植物；基因组编辑；CRISPR/Cas9

文献综述

  1. CRISPR/Cas系统
    1. CRISPR/Cas系统的发现

CRISPR序列最早是由日本科学家于1987年在大肠杆菌基因组中发现的一段特殊串联间隔重复序列，因当时并未对细菌、病毒、外源质粒进行过测序，其基因序列未知，因此并未发现这种串联重复结构在细菌和古细菌中广泛存在且其中的间隔重复序列（Spacer）跟

与宿主菌染色体外的遗传物质具有高度同源性，因此并未引起科学家们的注意[1-4]。随着测序技术和生物信息学的发展，这段特殊序列被更多的科学家发现并注意到，因此开始了对CRISPR序列的广泛研究，陆续发现其与宿主菌的后天性免疫系统有关。2002年，在嗜热链球菌完成全基因组测序后，Horvath等人首次提出CRISPR概念，并提出CRISPR可能与噬菌体的免疫系统有关[5]。2007年，Barrangou和Marraffini等人的研究首次发现并证明了在细菌中可以利用CRISPR系统产生的核酸酶和解旋酶将外源噬菌体的基因组进行切割并整合到CRISPR的重复序列中，形成记忆。当同种噬菌体再次入侵时能迅速形成免疫，抵挡其入侵[6]。2012年，Jinek等人首次在体外重构CRISPR/Cas9系统，并在体外实现了精确的DNA切割[7-8]，这标志着CRISPR/Cas9基因组编辑技术的成功问世。2013年，美国华裔青年科学家张峰在Science上发表了基于CRISPR/Cas9 技术的一种新方法，是利用具有靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体位点，从而对特定基因进行切割从而造成突变[9]。同年，Mali 等人也在Science上发表论文，他们发现利用改造的 CRISPR/Cas9 系统可在人类不同细胞系的靶点形成单链或双链切口，从而激活细胞的修复机制，高效介导定点突变与外源基因的定点插入[10]。2016年，Cas13a(C2c2)蛋白[11]也相继被发现，进一步丰富了CRISPR/Cas系统。从此进入了研究开发CRISPR基因编辑技术的黄金时代。

    1. CRISPR/Cas系统的组成

CRISPR/Cas系统的结构比较固定，其基因座由5rsquo;端的tracrRNA、Cas蛋白编码基因及CRISPR位点组成。CRISPR位点主要由1个前导区（Leader）、多个高度重复序列 (Repeat)和重复序列间的间隔序列(Spacer)串联组成。前导区一般位于CRISPR位点的上游，富含AT碱基，一般种内较保守。重复序列里包括回文结构，其转录出的RNA能形成保守且稳定的二级结构，在和Cas蛋白结合形成复合物的过程中发挥重要作用[12-14]。Cas蛋白基因一般位于CRISPR位点的下游，或分散在基因组的其他地方，其产生的蛋白在CRISPR系统作用时起到非常重要的作用。

图1 CRISPR/Cas系统的基本结构[15]

    1. CRISPR/Cas系统的作用机理

细菌和古生菌体内的CRISPR/Cas系统是应对外源噬菌体或质粒DNA时的获得性免疫系统，这个免疫过程被称为“CRISPR干扰”，可分为三个阶段：适应、表达、干扰。下面以噬菌体为例简要说明CRISPR/Cas系统抵御外来DNA的3个阶段。

      1. CRISPR/Cas系统适应阶段

当外来噬菌体入侵带有CRISPR/Cas系统的细菌时，细菌体内会产生CRISPR相关蛋白复合物，与噬菌体的DNA结合，并在Cas蛋白的作用下，将噬菌体DNA切割成长度不等的小片段，并在相关蛋白的作用下将其中一个小核苷酸片段整合到前导序列与第一个重复序列间的小间隔之间，和与插入同步进行复制产生的重复序列形成新的重复-间隔单元。这样，CRISPR/Cas基因座中就带有了该噬菌体的遗传信息，为后续的免疫打下结构基础[16]。

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