文献综述（或调研报告）：
无创性产前诊断的实现一直都是遗传学家和临床工作者的梦想。随着生物技术尤其是功能基因组学的发展进步，全面准确的进行无创产前甚至孕前的诊断已经成为可能。孕妇外周血DNA相关研究的发展进步，使得诸如21-三体综合征等产前诊断逐步走进临床，但是受制于胎儿DNA的低浓度以及母体DNA的背景干扰，许多胎儿遗传性疾病的诊断仍无法实现。故胎儿DNA的富集与分离至关重要，发展新的胎儿DNA富集方法对于无创产前诊断意义重大。
基于相关文献的调研，对目前国内外从孕妇血浆中富集cffDNA的基本方法策略及相关的研究手段有所了解。胎儿DNA富集方法主要包括两种——基于胎儿DNA片段大小和基于胎儿DNA的遗传特征。
- 基于胎儿DNA片段大小的富集方法
基于实时定量PCR测定和21-染色体特异性微卫星标记等早期工作，表明大多数游离的胎儿DNA通常比母体衍生DNA短，胎儿DNA大多数小于0.3kb，而来源于母体细胞的DNA序列平均大于1kb，因此可通过选择小于0.3kb的DNA片段以富集胎儿DNA。（Ying Li, et al,2004; Stephanie C. Y. Yu,2014）
研究表明，单个PCR系统中，不同DNA分子的Tm只与其长度和GC含量有关。如果降低GC含量对PCR扩增的影响，分子长度将成为影响变性温度的主要因素。当变性温度降低到一个合适的范围内，可以抑制较大DNA片段的扩增而不影响较小DNA片段的扩增;从而达到选择性扩增较小DNA片段的目的。如果修改扩增片段多态性（AFLP）的扩增反应条件来减少GC含量对PCR扩增的影响，增加引物与底物DNA的特异性连接并减少底物DNA的自我连接，可以建立一种基于PCR的富集方案，从而实现选择性的扩增cffDNA。实验验证了该方法可用于在含有不同片段大小的DNA的混合物的样品中选择性扩增较短片段，同时在扩增期间保持DNA片段的完整性，改善了cffDNA的富集和扩增，降低了母体cfDNA的背景水平，克服了胎儿特异性基因标记的限制，可以在一个简单的过程中产生大量的cffDNA，以满足常规临床NIPT的要求。(Qiwei Yang, et al,2017)同时也可以通过琼脂凝胶电泳（AGE）的方法对孕妇血浆中提取的DNA进行长度区分，通过分离长度小于300bp的片段作为胎儿的cffDNA以达到提高胎儿DNA浓度的效果。(Carolina J. Jorgez,et al,2009)
- 基于胎儿遗传和突变特征的胎儿DNA富集
胎儿DNA与母体DNA在片段的遗传标记等方面也有所不同，其中最常见的应用是利用SRY片段来验证分辨妊娠男性胎儿的母体血浆中的胎儿DNA。此外，DNA甲基化也是一种已被证实在不同组织间有显著差异的表观遗传差异，通过研究分析胎儿与母体的全基因组的甲基化谱，以证实并确定不同的甲基化区域（DMRs）的存在。通过使用甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)和下一代测序(NGS)技术，证实了胎儿特异性DMRs的胎儿与母体DNA甲基化水平明显不同，可以作为富集胎儿DNA的特异性遗传标记使用。MeDIP-NGS的双富集不仅可以高效地发现与确认胎儿特异性DMRs，还可以通过靶向的NGS对多个DMRs进行详细分析，同时还可以显著地增加胎儿特异性生物标志物的数量,为这种方法在最常见的胎儿非整倍体检测中的实施奠定了基础。（ANNA KERAVNOU, et al,2016）
利用男性胎儿DNA的遗传标记的特异性，还可使用Y-STR与STR片段作为特异性位点与底物对从孕妇血浆中提取的DNA进行PCR，从而分离富集其中的胎儿游离DNA，提高胎儿DNA浓度。（MACHIKO KIMURA, et al,2011）
（三）外泌体富集胎儿DNA
以往的研究已经确定了从胎盘释放的外泌体蛋白，以及生物活性脂质和胎盘特异性miRNA的存在。新的研究获得的数据表明，从孕妇血浆和血清中分离的外泌体不仅含有母体，而且含有胎儿来源的DNA。(Repiskaacute; G, et al,2018) 研究发现，包括胎盘细胞在内的多种细胞均可分泌外泌体，而胎盘细胞分泌的外泌体早在妊娠6周就已在母体循环中被发现，并且其浓度随胎龄增加而增加。侵入人类白细胞抗原-G （HLA-G ）绒毛滋养层细胞（EVT）是胎盘锚定基础，是子宫螺旋动脉开放以及防止母体对外来胎儿和胎盘组织产生免疫攻击的关键因素。孕早期，EVT与母体循环直接接触；因此，EVT衍生的外泌体可能存在于母体循环中。目前已经发现胎盘来源的外泌体具有合胞体滋养层特异性蛋白——胎盘碱性磷酸酶（PLAP）。此外，研究已确定PLAP阳性外泌体仅存在于孕妇的循环中。因此可利用免疫亲和捕获法特异性地从母体循环中分离胎盘外泌体，使用抗HLA-G和抗PLAP包被的珠分离绒毛外滋养层细胞（HLA-G ）和合体滋养层细胞（PLAP ）分泌的外泌体。(Lai, A., et al. ,2018)通过该方法进一步提纯胎盘外泌体，提高胎儿DNA在总DNA中所占的比例，从而对胎儿DNA产生一定的富集作用。
现阶段的胎儿DNA富集方法大多着眼于胎儿DNA与母体DNA片段长度的差异，基于胎儿DNA片段长度均小于300bp这一事实，通过不同的方法选择性扩增或筛选短片段DNA从而达到富集胎儿DNA的目的。除此之外，也有部分研究着眼于对于胎儿DNA特殊的遗传标记，染色体的缺失与重复，亚染色体大规模的缺失与重复等无创产前检测的项目，通过设计特定的引物与特异性生物标志，对孕妇血浆中的cffDNA进行靶向富集，以得到理想的检测结果，达到有效检测的目的。
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