文献综述（或调研报告）：
文献综述：
内含子保留是调节基因活性的有效方法之一，与其它基因活性调控方式相比，降解mRNA 链所需的能量较少，是一种普遍的基因调控机制。研究结果逐渐表明内含子保留在许多动物、植物的生物过程中发挥着重要且必要的作用，包括X 染色体剂量补偿的调控、组织特异性的蛋白多样化、mRNA的细胞定位、剪切调控和基因表达调控，参与了胁迫响应、疾病发生与治愈、发育、组织分化等生命活动。目前动植物内含子保留对基因功能的影响主要有三种机制：（1）通过激活NMD 途径下调mRNA 表达，进而下调蛋白的表达。内含子保留将激活NMD 途径，在总体转录通量一定的情况下，降解有内含子保留的mRNA, 可以增加有内含子保留的mRNA 的生成通量，使得无内含子保留的mRNA 表达水平下降，进而下调其蛋白表达水平，但不是所有的内含子保留都会激活NMD 途径。
（2）有内含子保留的mRNA 作为RNA 的存储，在特定的生理条件下被进一步剪切，实现目标mRNA 的快速大量生成，实现蛋白快速大量合成。这种情况下，含有内含子保留的mRNA 类似于“Sentinel” RNA。
（3）有内含子保留的mRNA 可翻译生成具有特定生物功能的新蛋白。内含子保留将影响蛋白质生成，包括蛋白质翻译的提前终止生成截短蛋白、含有由保留内含子编码肽段的新蛋白合成、移码突变或不翻译，使同一个基因产生多个蛋白变体。新蛋白的功能非常多样化，如：与正常蛋白（由无内含子保留的mRNA翻译生成）形成蛋白复合物，结合到启动子区域，实现转录水平的调控；调控正常蛋白的功能, 并且是正常蛋白发挥功能的必要因素；新蛋白具有与正常蛋白完全不同的亚细胞定位；新蛋白具有与正常蛋白完全不同的蛋白功能。其中，新蛋白产生并伴有NDM 途径激活是动植物内含子保留调控基因功能的常见机制。
里氏木霉（Trichoderma reesei）因其蛋白分泌量大（100 g/L）、遗传性状稳定、生长繁殖迅速、培养条件简单和生物安全性高，成为纤维素酶生产的主要工业模式真菌。根据里氏木霉的基因组，里氏木霉至少有10个编码beta;-葡萄糖苷酶的基因（cel1A、cel1B、cel3A、cel3B、cel3C、cel3D、cel3E、 cel3F、cel3G 和 cel3H）。人们通过基因敲除和工程菌酶活表征，研究了不同 beta;-葡萄糖苷酶对纤维素酶生成的影响和作用。如:（1）日本的 Wataru Ogasawara 的课题组发现，与野生菌株 QM9414 相比，纤维素高产菌株PC-3-7的beta;-葡萄糖苷酶 cel1A（bgl2）发生了单核苷酸突变V409F，是菌株 PC-3-7 高产纤维素酶的原因之一。该课题组还发现在以纤维二糖为碳源时，beta;-葡萄糖苷酶（bgl1 除外）表达的转录调控因子 BGLR抑制纤维素酶的生成。（2）美国的 Glass 课题组在粗糙脉胞菌中敲除了两个胞外beta;-葡萄糖苷酶和一个胞内beta;-葡萄糖苷酶得到粗糙脉胞菌（Neurospora crassa）工程菌 Delta;3beta;G。该工程菌在以纤维素为碳源的情况下，纤维素酶的表达量相对于出发菌株降低，但在以纤维二糖和纤维三糖为碳源的情况下，纤维素酶的表达量比出发菌株高。通过这些实验结论可以得出，beta;-葡萄糖苷酶在纤维素酶生成中扮演着重要的角色。
纤维素酶（beta;-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶。其中参与纤维素降解的主要有三种酶：内切葡聚糖酶（EG，EC3.2.1.4），外切葡聚糖酶（或纤维二糖水解酶，CBH，EC3.2.1.91）和beta;-葡糖苷酶（BGL，EC 3.2.1.21），此外还有很高活力的木聚糖酶，它们作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。纤维素降解的大致过程为：首先，内切葡聚糖酶将纤维素降解成纤维寡糖，然后纤维寡糖在纤维二糖水解酶的作用下降解成纤维二糖，最后纤维二糖在beta;-葡萄糖苷酶的作用下水解为可发酵性葡萄糖。EG内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，水解纤维素非结晶区内部的糖苷键，主要产生纤维糊精和低聚糖，形成不同长度的寡糖和新链的末端；CBH外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，从纤维素链的还原端或非还原端释放纤维二糖单元或葡萄糖；然后BGLbeta;-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖，并且释放可发酵的d-葡萄糖。
纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程，纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由beta;-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和beta;-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。
纤维素酶的最适pH一般在4.5-6.5。葡萄糖酸内酯能有效的抑制纤维素酶，重金属离子如铜和汞离子，也能抑制纤维素酶，但是半胱氨酸能消除它们的抑制作用，甚至进一步激活纤维素酶。植物组织中含有天然的纤维素酶抑制剂，它能保护植物免遭霉菌的腐烂作用，这些抑制剂是酚类化合物。如果植物组织中存在着高的氧化酶活力，那么它能将酚类化合物氧化成醌类化合物，后者能抑制纤维素酶活。影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。张中良等采用均匀设计Cl12(1210)，以绿色木霉（Trichoderma viride）为菌种，研究了影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，认为基质粗纤维含量为40%、初始pH 7.5、加水4倍、在26-31℃条件下培养45 h可获得最大产酶量26 mg/g和CMC酶活力20 mg/g·h。王成华等也研究了其诱变筛选的里氏木霉91-3的产酶条件，结果表明该菌种以7：3的秸秆粉和麦麸，另添加4% 硫酸铵、0.4% 磷酸二氢钾、0.1% 硫酸镁为最佳培养基，28-32 ℃为适宜培养温度，30 ℃为最佳温度，4% 为最佳接种量，96 h到达发酵高峰。张苓花等研究了以康氏木霉W-925为出发菌，经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的最佳发酵条件。结果表明，以1：2的麦麸和稻草粉为培养基，5% 的接种量，稻草粉碎平均长度3-5 mm，初始pH 4-5，温度在28-35 ℃，发酵时间72 h为最佳发酵条件。
丝状真菌由于其具有超强的蛋白分泌能力，近年来一直受到科学家和工业生产的喜爱，然而外源蛋白的分泌量大不如内源蛋白的分泌量，人们猜测这可能和转录后的瓶颈有关。因此，转录后发生的蛋白质分泌途径以及分泌机制成为了异源蛋白分泌瓶颈的可能，也成为了人们研究的热点。人们认为丝状真菌中蛋白的分泌主要发生在菌丝顶点处，但是目前关于分泌机制的研究还很少。蛋白分泌途径包括两种：一种是常规分泌路径，第二种是非常规分泌路径。常规分泌路径比较常见，即蛋白质首先到达内质网，在内质网中，蛋白质经过糖基化作用、二硫键形成、磷酸化以及亚基形成等方式被折叠和修饰。内质网也起着控制蛋白质量的作用，错误折叠蛋白在内质网被分类并输送到蛋白酶体或者液泡中。随后，蛋白质离开内质网通过转运囊泡进入高尔基体，并在高尔基体中经过进一步的折叠和修饰。最后，蛋白经由分泌囊泡运送到质膜以及外泌体。在蛋白质的囊泡运输过程中，囊泡上存在一个v-SNARE并且在目标细胞器上存在三个t-SNAREs，它们相互作用，介导囊泡膜和细胞器膜之间的交互作用。最近在稻瘟病菌的研究中发现，内质网不仅存在于顶端，还存在于次顶端细胞周围区域和附近的膈上，这也表明蛋白质的分泌可能不一定只发生在顶端位置。内质网中正确加工的蛋白质被运输到高尔基体进行进一步的修饰，随后，分泌蛋白和质膜蛋白由外泌体输送到细胞质膜。在里氏木霉中有两种质膜突触样t-SNAREs、Sso1p和 Sso2p。Sso1p和Sso2p分别在菌丝接近顶点的区域或者是顶端区域分别和v-SNARE的Snc1p相互作用。Sso1p可能对含有水解酶的囊泡和质膜的融合起到非常大的作用。Sso2p可能介导质膜以及含有细胞造壁酶以及支持顶端生长的某些成分的囊泡之间的相互作用。总之，里氏木霉中至少存在两种不同的分泌途径，分别为Sso1p依赖的途径和Sso2p依赖的路径。纤维素酶在内质网中产生，经过高尔基体到达菌丝顶端，大量分泌到胞外培养液中。然而其中只有少量的beta;-葡萄糖苷酶BGL1分泌到细胞外，这使得纤维素的降解只停留在产生纤维二糖上，并且纤维二糖的积累以及代谢终产物葡萄糖的产生都会抑制纤维素酶的产生，导致纤维素降解效率的降低。此外，工业上收集纤维素酶只是收集上清液中的纤维素酶，无法同时收集胞内的BGL1，导致所得纤维素酶液中的BGL1的含量很低，无法充分降解纤维素。该问题只能通过提取不同发酵液中的纤维素酶进行混合来解决，这样大大增加了生产成本。
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