基于微流控的全基因组扩增技术研究文献综述

文献综述（或调研报告）：

微流控是指使用微细管道控制或处理微流体的技术，其主要特点就是能将生化实验中的样品制备、反应、检测等实验操作集成在一块微米尺度的芯片上，我们通常称其为微流控芯片。微流控技术起源于1990年，Manz等人在1990年首次提出微型全分析系统的概念，并且实现了在芯片上进行电泳分离的实验。从此拉开了微流控技术的序幕。由于微流控技术有高分辨率和高灵敏度成本低、分析时间短、体积小等特点。所以随后，微流控技术便高速发展。目前主要的微流控芯片制作方法有模塑法、热压法、激光烧蚀法等。

由于微流控技术有着非常多的优点，所以微流控芯片在各方各面的应用也十分广泛。目前主要应用的方面有体外诊断（器官芯片、活体检测）、环境和生化分析、单细胞分析、基因测序、PCR反应、药物筛选等。

同样的全基因组扩增技术也凭借其优点被广泛应用。目前的全基因组测序技术主要分为三大种类：一是基于PCR的全基因组扩增技术，例如简并寡核苷酸引物PCR扩增技术（degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR）等；二是基于恒温扩增的全基因组扩增技术，例如多重链置换扩增技术（multiple displacement amplification，MDA）等；三是混合型全基因组扩增技术，例如多次退火环状循环扩增技术（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）等。由于这三大类全基因组扩增技术是基于不同的生化原理的，所以这几类全基因组扩增方法也有着各自的优缺点及适合的应用场景。下面我以DOP-PCR、MDA、MALBAC为例，分别介绍这三类全基因组扩增技术的扩增原理、优缺点及适用场景。

1、DOP-PCR

DOP-PCR是一种基于PCR即聚合酶链式反应的全基因组扩增技术。其主要过程是在初期的几个循环中使用较低的温度约25℃左右，以使得模板和引物充分结合，然后提高温度使引物延伸，最后运用较高的温度进行退火约55℃左右，以实现多循环的PCR扩增。其使用的引物为局部简并引物，该引物的特点是引物所有碱基中有六个随机碱基。其主要作用是通过6个随机引物能够覆盖模板基因组中尽可能多的区域，从而实现整个基因组的扩增。该方法拥有操作简单、反应快速、成本低廉等优点，但由于其扩增情况受实验条件影响较大，如聚合酶浓度、引物浓度等，并且由于引物结合的随机性，DOP-PCR有着较低的灵敏度以及错误率高等缺点。同时由于后续扩增导致的指数性放大最初扩增差异。因此，DOP-PCR的扩增结果中会存在大量过度扩增以及扩增不足的区域。虽说DOP-PCR有着比较多的缺点但是其整体上还是能很好的还原大于1Mb的大范围区域的拷贝数水平，所以它经常被用作拷贝数变异检测中。

2、MDA

MDA即多重置换扩增反应是一种基于恒温扩增的全基因组扩增技术，该技术相对于基于PCR的全基因组扩增技术发明的较晚。该扩增反应全程在30℃的恒温环境下进行。引物方面，它采用的是一条硫代修饰的六核苷酸的随机引物，其能够在30℃的恒温条件下与基因组随机退火，并且由于其引物6个核苷酸是随机的，所以能够使得引物均匀的分布在整个基因组上。聚合酶方面，MDA采用的聚合酶是phi;29聚合酶，这种聚合酶具有强烈链置换特性以及很强的3rsquo; - 5rsquo;外切酶活性和校读活性。这就使得扩增出来的DNA有着较高的保真性。phi;29聚合酶在DNA上的多个位点同时进行扩增，生成的新链在phi;29聚合酶的作用下发生链置换反应，置换产生的单链又能通过与随机引物相结合进行下一步扩增。phi;29聚合酶还具有着较强的持续合成DNA的能力，所以MDA方法可以合成长达50-100Kb的产物。

MDA的引物随机性使得它具有十分优秀的基因组覆盖度，同时该方法操作简单、对实验器材要求低以及对模板量要求低等特点。虽然MDA有扩增偏好性等缺点，但其凭借高保真、高质量、对模板量要求低等特点仍是目前使用最广泛的全基因组扩增技术，在基因组测序、CGH、SNPs分析等领域中仍有广泛的运用。

3、MALBAC

MALBAC即多次退火环状循环扩增技术，是综合了基于PCR的全基因组扩增技术和基于恒温的全基因组扩增技术的特点并进行改进的一种混合型的全基因组扩增技术，它由谢晓亮等人于2012年在《Science》期刊上发布。之所以说它是前两种全基因组扩增技术的特点的融合，是因为它运用了类似MDA的引物退火过程，以及运用了PCR循环的扩增方法。

MALBAC运用的35个碱基长度的引物，其由一段固定的27个核苷酸碱基组成通用的引物序列和8个随机核苷酸碱基组成的序列组成。在扩增反应初期，0℃条件下，8个随机核苷酸碱基组成的序列随机在模板链上结合，以保证引物结合的均匀性和广泛性。然后升温至65℃，在Bst聚合酶的作用下发生链置换反应，从而得到一系列不同长度的半扩增子（仅一端含有通用序列）。之后以原始模板链和生成的半扩增子进行PCR循环：95℃变形、0℃退火、65℃延伸。使用模板链再生成半扩增子，使用半扩增子生成全扩增子（两端均含有互补通用序列），再将温度调整到58℃使得全扩增子两端互补形成环状结构。由于这个设计使得全扩增子不会再参与后续扩增反应。在多次循环后，DNA线性扩增得到大量全扩增子，这些全扩增子都是模板链的二代扩增产物。这样极大程度的避免了反复迭代扩增以及指数型扩增导致的累计偏差，提高了扩增精度。最后，我们使用传统的指数型PCR扩增技术扩增生成的全扩增子，得到大量的扩增产物以供基因组测序。

由于MALBAC综合了PCR方法和恒温方法的特点，解决了传统扩增模式中因多次扩增而导致的累积误差。因此，该方法有均一性好、覆盖度高、准确性高等特点。但是由于使用的Bst聚合酶为大片段酶，该酶的工作温度较高，因此，在合成DNA时会造成一定的错误，这就导致了MALBAC在单核苷酸变异（SNVs）中的假阳性率高的问题。即使是这样，MALBAC依然广泛的运用在单核苷酸变异(SNVs)以及拷贝数变异(CNVs)的研究中，并且能提供不错的检测精度。