一、实验背景
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一类特异性作用于血管内皮细胞的细胞。最早在1983年由Senger 等发现， 由两条8个外显子和7个内含子组成的23 kD 的单链蛋白构成，是一种主要在婴儿时分泌以促进血管形成和生长的因子,正常的成年人只在受伤等病理情况下分泌VEGF。而各种癌细胞均分泌VEGF 和可促进VEGF表达的其他蛋白因子。
天然 VEGF 是由两条糖蛋白链形成的二聚体。 目前发现VEGF 至少有5种亚型, 根据单体残基数不同分别为VEGF121 , VEGF145 , VEGF165 , VEGF189 和 VEGF206 ,其中VEGF121和 VEGF165是以可溶性蛋白形式分泌于细胞外发挥生物活性, 其他则与胞外基质结合而被储存。实验发现VEGF在大多数动物和人的肿瘤细胞中高表达，多集中在肿瘤血管周围。肿瘤组织的生长需要新血管的生成来提供足够的氧气和其他营养物质，VEGF是一种与血管生长有关的特异性的细胞因子，并且是目前被认为特异性最强直接作用于血管内皮细胞的生长因子。VEGF可与内皮细胞表面特异受体结合,能促进血管内皮细胞的增殖从而使得血管肿瘤产生大量结构和功能异常的血管并通透性增加，促进肿瘤的生长，故肿瘤生长的恶性循环由此产生。肿瘤组织的VEGF表达显著增加，同时表达增加的VEGF又将促进肿瘤细胞的增殖与转移，故VEGF的抗体具有能抑制肿瘤生长的作用。研究表明，VEGF及其受体在癌症的淋巴结转移和淋巴管形成方面也发挥积极的作用。其机制可能是因VEGF高表达促使血管基底膜水解，癌细胞从血管通透性增高的毛细血管游出进入淋巴管， 导致淋巴转移。
VEGF165的原核表达研究早有报道,但由于原核细胞不具备蛋白糖基化功能,且表达产物多为包涵体,复性困难，会影响到VEGF的生物活性和免疫原性。因此,对VEGF 的真核表达产物的研究受到了人们的重视。此次实验使用酵母菌作为宿主细胞进行VEGF165的发酵制备。使用的Pichia酵母是一种嗜甲醇酵母,可通过甲醇诱导重组蛋白的表达。该表达系统因其表达量高、可操作性强以及对产物的真核系统后加工能力而深受研究者的青睐。
- 实验目的和意义
以酵母菌为宿主细胞真核表达VEGF165，分离并提纯后再依次进行产品浓度、纯度和抗原效价的检测。
三技术路线图
VEGF产生菌发酵表达收集产物
VEGF蛋白鉴定及Western Blot蛋白表达验证
BCA测蛋白浓度
ELISA测定VEGF抗原效价
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