诱变选育高产谷胱甘肽酵母菌及培养条件的优化文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一．研究背景

谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的活性三肽物质,具有防辐射、抗氧化、解毒、治疗眼科疾病等功能,被越来越多的应用于食品、化妆品、医药等领域,在我国有巨大的潜力和市场。日本的等国家对发酵法生产GSH研究的己经很深入,但是国内对于发酵法生产GSH还处于实验室阶段,限制其产业化的关键因素是产量和成本。虽然中国一直致力于发酵法生产GSH研究,并取得了较大的进步,但距离产业化的生产还存在一定的差距,原因是菌株GSH的产量太低,如何在最大程度发挥出菌株生产潜力,提高生产水平,是目前迫切要做的工作,是保证谷胱甘肽稳定、持续、高效工业化生产提供的理论依据和技术支持。

目前，合成谷胱甘肽的方法主要有溶剂萃取法、化学合成法以及生物合成法，前两种方法由于操作复杂、产率不高、成本过高等原因而应用价值不大。生物合成法有酶合成法和发酵法，前者由于需要昂贵的氨基酸前体和ATP，仍处于实验室阶段。近几十年来采用发酵法生产GSH的各种工艺和控制方法不断得到改进，使得发酵法成为生产GSH最普遍的方法，它具有菌种易于培养、原料来源方便廉价、成本低和生产速率快等优点。最常用的菌株是酵母菌，尤其是酿酒酵母和产阮假丝酵母。

二．研究目标及内容,以及拟解决的关键问题

1.研究目标

（1）通过单因素实验找出影响酵母培养及GSH产量的因素

（2）通过响应面分析确定酵母培养的最佳发酵条件

（3）探讨谷胱甘肽产量提高的机理

2.研究内容

（1）单因素实验

研究葡萄糖,酵母粉,(NH4)SO4,KH2PO4,MgSO4,生物素，半胱氨酸这七个因素对酵母产谷胱甘肽的影响，以便进行下一步实验。分别得到各因素较适宜的一个范围。

（2）响应面分析

根据单因素实验结果，确定各因素的水平，运用Minitab16软件进行Plackett-Burman实验,共12组实验，每组重复3次，根据实验结果，P值小于0.05的为显著因素。从以上7个因素中筛选出3个显著因素。根据Plackett-Burman实验结果，包括P值、效应、系数等，进行最陡爬坡实验，即设定步长及变化方向进行实验，找出峰值，以寻找快速最佳的响应区域。最陡爬坡实验结果的最大值所对应的各因素的水平即为中心组合实验的中心点。根据以上实验结果，进行中心组合设计，共20组实验，每组重复3次，运用软件建立3个显著因素的多元二次方程，进行方差分析，比较拟合性，建立回归模型并进行验证。

（3）探讨谷胱甘肽产量提高的机理

本课题采用的是在酵母的发酵培养基中添加低浓度的生物素和半胱氨酸，再以培养基中的葡萄糖，酵母粉，(NH4)SO4,KH2PO4,MgSO4,生物素，半胱氨酸作为优化参数，采用响应面法对酵母的发酵培养基进行了优化，以提高谷胱甘肽的产量。

3.拟解决的关键科学问题

本课题研究的关键问题主要是确定影响谷胱甘肽产量的酵母发酵培养基中的主要因素，确定因素水平以及响应值的测定，利用响应面法分析结果。

解决思路：发酵过程存在严重的交互作用，要做比较全面的单因素实验，再进行组合试验。进行PB实验多考察一些因素，然后再减少因素并进一步探索因素间的交互作用。

三．拟采取的研究方案

本课题通过优化发酵培养基成分以提高酵母菌产谷胱甘肽的产量。首先进行的是单因素实验，找出对酵母菌培养有影响的几个因素；在单因素实验的基础上，进行Plackett-Burman实验，找出影响谷胱甘肽产量的最显著的几个因素；接着进行最陡爬坡实验，逐渐逼近最佳响应区域；最后进行中心组合实验，建立多元二次回归方程，得到最佳培养条件，进行回归模型验证。

1、单因素实验

葡萄糖浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L和60g/L,酵母粉浓度分别为3g/L、5g/L、7g/L、9g/L和11g/L，硫酸铵浓度分别为4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L和9g/L；生物素浓度分别为100mu;g/L、200mu;g/L、300mu;g/L、400mu;g/L、500mu;g/L和1mg/L；半胱氨酸浓度分别为2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L和10mmol/L；MgSO4浓度分别0.5g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L和2.0g/L。通过测定发酵结束时谷胱甘肽的含量，确定各因素各水平对产量的影响。

2、响应面分析

首先运用Mintab16软件进行Plackett-Burman实验。根据单因素实验结果，对以上7个因素进行Plackett-Burman实验，每个因素均为2水平，葡萄糖浓度分别为20g/L、30g/L，酵母粉分别为5g/L、7.5g/L,(NH4)SO4浓度分别5g/L、7.5g/L,KH2PO4浓度分别6g/L、9g/L,MgSO4浓度分别为1.5g/L、2.25g/L,生物素浓度分别为0.1mg/L、0.15mg/L,半胱氨酸浓度分别为4mmol/L、6mmol/L，共12组实验，每组重复3次，从以上7个因素中筛选出3个显著因素。根据Plackett-Burman实验结果，包括P值、效应、系数等，进行最陡爬坡实验以确定中心组合实验的中心点，即设定步长及变化方向进行实验，找出峰值，以寻找快速最佳的响应区域。最陡爬坡实验有6组实验，每组重复3次，取平均值，最大值所对应的各因素的水平即为中心组合实验的中心点。根据以上实验结果，进行中心组合设计，共20组实验，每组重复3次，运用软件建立3个显著因素的多元二次方程，进行方差分析，比较拟合性，建立回归模型并进行验证，得到最佳发酵条件。

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